丹参酮 Ⅰ 在肝缺血再灌注损伤小鼠模型中的保护作用

易小康，杜毅超，钱保林，黄治伟，李 秋，付文广，温 剑

西南医科大学附属医院 a. 四川省院士(专家)工作站； b. 普通外科(肝胆方向)，四川 泸州 646000

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)是肝移植和肝切除术不可避免的临床问题[1]。HIRI在临床中能造成患者严重的肝功能障碍，甚至肝衰竭、多器官功能衰竭和死亡，其发生机制复杂，涉及自噬、炎症激活、细胞凋亡、氧化应激[2-4]等多个方面。目前HIRI尚无特异性药物治疗手段，探索HIRI新的治疗药物有重要的临床意义。

丹参为中国传统中草药，在冠心病、脑卒中及闭塞性动脉炎等心脑血管疾病中已证实具有良好的治疗效果[5-6]。丹参酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ, T-Ⅰ)为丹参根部的主要的脂溶性有效成份之一，在多种疾病动物模型中均表现出良好的抗氧化应激能力，如脑缺血再灌注损伤、帕金森氏病以及砷诱导的肺部炎症等[7-10]。然而，尚无研究表明T-Ⅰ是否在HIRI中有保护作用。本研究通过建立HIRI小鼠模型，探讨T-Ⅰ在HIRI中的保护作用，希望为HIRI这一临床难题探索新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6J健康雄性小鼠36只，8～12 周龄，体质量(22±2)g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK(京) 2015-0015，实验动物使用许可证编号：SYXK(川) 2013-181。

1.2 主要试剂 T-Ⅰ(货号: T118876)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，ALT、AST检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)与氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide, GSSG)检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、Caspase 3 活性检测试剂盒、血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)兔多克隆抗体、二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司，Caspase-3兔多克隆抗体购自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及处理 将经过适应性饲养1周后的36只C57BL/6J健康雄性小鼠随机分成6组: 假手术(sham,n=6) 组、缺血再灌注(IR,n=6)组、IR+T-Ⅰ(5 mg/kg)组(n=6)、IR+T-Ⅰ(10 mg/kg)组(n=6)、IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组(n=6)和IR+T-Ⅰ(40 mg/kg)组(n=6)，各组均腹腔注射给药，假手术组与模型组注射等量溶剂橄榄油，IR+T-Ⅰ组给药1次/d，连续给药7 d，末次给药2 h后建立70% HIRI模型。

1.3.2 肝缺血再灌注动物模型构建 术前12 h禁食，麻醉后消毒铺巾，按照Gao等[11]的方法，取上腹正中切口，分离肝脏周围韧带，暴露第一肝门，无损伤血管夹钳夹闭肝左、中门静脉及肝动脉分支，构建70%的缺血，阻断后可见被相应肝叶由鲜红色变为苍白色即表示肝缺血成功，60 min后松开血管钳恢复血流，即行再灌注6 h。假手术组小鼠开腹后仅游离第一肝门，不阻断血流。各组小鼠于再灌注6 h后眼球取血法收集血液，离心取上清液，-80 ℃保存。处死小鼠，取左、中叶肝组织用于后续实验。

1.3.3 血清ALT、AST检测 小鼠眼球取血，于1000 r/min 4℃离心10 min，取上层血清，使用ALT、AST测试盒，严格按照测试盒说明书步骤操作检测ALT和AST。

1.3.4 肝组织中MDA、SOD、GSH和Caspase-3检测 严格按照试剂盒说明书进行操作，小鼠肝组织使用PBS匀浆后，12 000g离心10 min，收集上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白浓度，检测MDA水平；小鼠肝组织使用SOD样品制备液在4 ℃匀浆后，12 000g4 ℃ 离心3 min，取上清作为待测样品检测SOD水平；小鼠肝组织使用新鲜配置的蛋白去除试剂M溶液在4 ℃匀浆，4 ℃放置10 min后，10 000g4 ℃ 离心10 min，收集上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白浓度，检测GSH水平；小鼠肝组织使用试剂盒提供的裂解液匀浆后，冰浴再裂解5 min，4 ℃ 16 000～20 000g离心10～15 min，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白浓度，检测Caspase-3水平。

1.3.5 组织学分析 将肝中叶在4%的多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察肝组织损伤情况。

1.3.6 免疫组化分析 将肝中叶于室温下4%的多聚甲醛固定，常规制备石蜡切片，经石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭等步骤后，分别滴加HO-1(1∶100)或caspase-3(1∶100)抗体4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶100稀释)覆盖组织，室温孵育50 min，加新鲜配制的DAB显色液显色完全后，复染细胞核、脱水封片，显微镜下观察、拍照，棕褐色为阳性。

1.3.7 TUNEL法检测肝细胞凋亡水平 将肝中叶室温下4%的多聚甲醛固定，常规制备石蜡切片，对石蜡切片进行脱蜡处理，严格按照说明书使用TUNEL试剂盒检测肝组织凋亡。显微镜下观察、拍照，棕褐色为阳性。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由西南医科大学实验动物伦理委员会审批，批号：201906-50，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 T-Ⅰ降低小鼠肝脏缺血再灌注模型中ALT、AST水平 与sham组比校，IR组的血清ALT、AST水平显著升高(P值均<0.01)；用不同浓度的T-Ⅰ预处理后，各组血清ALT、AST水平较IR组明显下降(P值均<0.01)(表1)，且IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的治疗效果最佳，故20 mg/kg为IR模型中的最佳治疗浓度。

表1 5组间ALT、AST水平的比较

2.2 T-Ⅰ减轻小鼠肝脏缺血再灌注模型肝组织病理损伤 HE结果显示,sham组小鼠肝细胞形态正常，胞核居中大而圆，肝细胞无坏死及炎性细胞浸润，肝小叶结构完整，肝索排列齐整。IR组可见肝组织损伤严重，肝细胞灶性或大面积变性坏死，细胞核被挤向一边，细胞间界限不清，肝小叶结构紊乱，肝索排列不规则，表明HIRI模型成功。与IR组比较，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的小鼠肝脏病变明显缓解，肝组织炎症浸润轻微，细胞轮廓仍清晰可见，未见到大面积坏死灶，局部见肝细胞坏死，肝组织结构基本完整(图1)。

注：a，sham组；b，IR组；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组。

2.3 T-Ⅰ抑制小鼠HIRI模型肝组织凋亡 TUNEL结果显示，Sham组无明显凋亡肝细胞，与Sham组比较，IR组见大片凋亡肝细胞；与IR组比较，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的小鼠凋亡肝细胞明显减少(图2)。免疫组化染色结果显示，Sham组无明显Caspase-3蛋白表达，与Sham组比较，IR组见大量Caspase-3蛋白表达。与IR组比较，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的Caspase-3蛋白表达明显减少(图3)。相应的，将肝组织匀浆后检测Caspase-3活性，与sham组比较，IR组的Caspase 3 活性显著升高(P<0.01)；与IR组比较，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的Caspase 3 活性明显下降(P<0.01)(表2)。

注：a，sham组；b，IR组；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组。

2.4 T-Ⅰ增强小鼠HIRI模型的肝脏抗氧化能力 与sham组比较，IR组小鼠肝组织中MDA的水平显著升高，SOD活性及GSH水平显著降低(P值均<0.01)；与IR组比较，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的MDA水平显著降低，SOD活性及GSH水平明显升高(P值均<0.05)(表2)。免疫组化结果显示，sham组小鼠肝组织中未见HO-1表达，而IR组可见HO-1蛋白表达；与 IR组比较，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组的HO-1表达明显升高(图4)。

表2 3组间MDA、SOD、GSH、Caspase-3水平的比较

注：a，sham组；b，IR组；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组。

注：a，sham组；b，IR组；c，IR+T-Ⅰ(20 mg/kg)组。

3 讨论

HIRI是肝切除、肝移植术后肝功能障碍和肝衰竭的主要原因[12]，预防和治疗HIRI已成为临床研究重要的课题之一。目前认为，抗HIRI最有希望的方法是预处理和药理学方法[13]。近年来，越来越多研究[14-16]发现中草药在HIRI过程中的保护作用。T-Ⅰ为丹参根部的主要脂溶性有效成份之一，具有强力的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。既往多项研究[7-10,17]表明，T-Ⅰ在肾脏缺血再灌注小鼠模型、脑缺血再灌注小鼠模型、帕金森氏病小鼠模型、砷诱导的肺部炎症等众多小鼠模型中均可通过抗氧化活性发挥强大的治疗作用。近期研究[18-19]发现，丹参的另一脂溶性成分丹参酮ⅡA预处理后可减轻老鼠的HIRI损伤，然而，迄今为止，国内外均无研究表明T-Ⅰ是否在HIRI中有保护作用。目前HIRI没有确切有效的干预方法[20]，其发生机制复杂，涉及多方面因素，其中，再灌注产生大量活性氧物质诱导产生的氧化应激是导致HIRI的主要机制[21]，因此，调控肝内氧化应激可能为HIRI的有效治疗开辟新的途径，故T-Ⅰ可能通过抗氧化活性对HIRI起到保护作用。为了明确这一假设，笔者首次将T-Ⅰ应用在HIRI模型中，发现其对HIRI起到了确切有效的保护作用，证实其保护作用与抑制肝脏氧化应激反应和肝细胞凋亡有关。

在某些情况下，氧化应激的升高水平可以维持很长时间，这取决于氧化还原平衡的状态，改变的氧化还原稳态可能对细胞器官功能有不同的影响。GSH作为最丰富的非蛋白硫醇存在于所有哺乳动物组织中，是一种主要的抗氧化剂，它能清除多种活性氧物质，抵御氧化应激[22]。它直接作为自由基清除剂和谷胱甘肽过氧化物酶的底物，减少过氧化氢和脂质过氧化物，还可与外源性物质和/或其代谢物结合，并在解毒过程中发挥重要作用[23]。SOD是体内主要的抗氧化酶，可清除超氧自由基，对氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,其活性代表了组织清除自由基的能力，SOD缺乏更加容易受到氧化损伤[24]。氧化应激过程中，自由基的增加会导致脂质过氧化加速，MDA是脂质过氧化反应的最终产物,可间接反映体内氧自由基的代谢状况和机体细胞受自由基损害的程度[25]。HO-1作为机体抗氧化应激的关键保护因子，在氧化应激下通过抗氧化、抗凋亡等机制发挥保护作用，减轻缺血再灌注损伤[26-27]。在本研究中，经手术构建70%肝缺血再灌注模型后，小鼠肝组织中MDA明显增加，SOD及GSH水平明显降低，表明HIRI小鼠抗氧化能力极大程度降低，发生了严重的氧化应激损伤。而通过腹腔注射T-Ⅰ预处理，与IR组相比，小鼠肝组织中MDA降低，SOD及GSH的水平回升，表明T-Ⅰ可明显提高肝组织的抗氧化能力，抑制HIRI对小鼠肝组织的氧化应激损伤。HE染色、免疫组化等结果显示T-Ⅰ预处理后可减轻肝组织病理损伤，抑制肝细胞凋亡，增强抗氧化因子HO-1的表达。

综上所述，从丹参中提取的T-Ⅰ可明显缓解HIRI，提示T-Ⅰ可能是一种具有明显保肝护肝作用的候选药物，作用机制可能与其抑制肝脏氧化应激反应和凋亡有关。但T-Ⅰ却还拥有抗炎、诱导保护性自噬[22]等作用，在本实验中T-Ⅰ是否可通过其他途径从而对肝缺血再灌注产生保护作用犹未可知。尽管T-Ⅰ在体外和体内模型中均显示出重要的生物学特性，但其不良的溶解性和生物利用度限制了其临床应用[28-29]。进一步探讨T-Ⅰ在HIRI中的调控机制，改进T-Ⅰ的药物制剂将可能为HIRI的治疗提供新的方法及理论依据。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：易小康、杜毅超、钱保林、付文广等负责课题设计，资料分析，撰写论文；易小康、黄治伟、温剑等参与收集数据，修改论文；李秋、付文广、温剑等负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。