咖啡酸酰胺类衍生物的设计、合成及体外抗肿瘤活性研究

王 杰 张 晖 付映林 孙贝尔 刘 莹 史冬雅 高子舜 杨亮亮

（蚌埠医学院公共基础学院 安徽蚌埠 233030)

肿瘤已成为造成人类死亡的第二大杀手[1]。据报道，我国癌症的发病率高达201.1∕10万，其中肺癌、乳腺癌、肠癌为我国第一、二、三名高发癌，严重威胁着人民生命安全和身体健康[2，3]。目前临床针对癌症的治疗手段主要包括外科治疗、化疗、放疗及分子靶向治疗，以中药小分子为模型化合物开发抗肿瘤化疗、靶向治疗药物成为了科研工作者研究的热点。

咖啡酸(图1)，又称3，4-二羟基肉桂酸，广泛存在于金银花、缬草、麝香草等植物种，工业多通过Knoevenagel-Doebner缩合反应进行合成。在临床中咖啡酸片主要被用于预防外科、妇产科等手术出血和血小板减少症。近代药理学研究表明，咖啡酸也具有抗肿瘤、抗氧化和脑保护等生理活性[4]，但其对胃肠道具有刺激和生物利用度低等缺点，限制了其临床运用。近年来，以咖啡酸为先导化合物，开发高效低毒的具有抗肿瘤作用的咖啡酸衍生物备受关注。王月华[5]等研究显示，咖啡酸苯乙酯(图1)对A549、Hela、MCF-7肿瘤细胞增值和迁移具有较好的抑制作用。唐双意[6]等报道，迷迭香酸(图1)可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的增值，拮抗肠癌细胞Ls174-T转移。另有研究显示[7]，丹酚酸A(图1)等咖啡酸衍生物也具有抗肿瘤活性。

四氢异喹啉类生物碱作为一种天然产物在毛茛科、小檗科等植物中分布广泛，具有广泛的生物活性，如抗血小板聚集、抗肿瘤、抗病毒等。Leese[8]等设计、合成了系列四氢异喹啉衍生物，其中化合物6、7、8(图1)对burkitt淋巴瘤细胞增值具有较好的抑制作用。雷春花[9]等设计合成的异喹啉类生物碱TW9183(图1)对A549、Hela的增值、迁移具有较好的抑制作用。

图1 咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、迷迭香酸、丹酚酸A、化合物（6、7、8）、TW9183结构

为了降低咖啡酸对胃肠道的刺激、提高生物利用度，开发新型高效低毒抗肿瘤药物，本文作者利用生物电子等排原理和拼合原理，设计了3个咖啡酸酰胺类衍生物，合成路线见Scheme。采用SRB法对3个咖啡酸酰胺类衍生物体外抑制A549、MCF-7、HT-29肿瘤细胞增值活性进行了初步筛选。

Scheme 咖啡酸酰胺类衍生物的合成路线

一、实验部分

（一）仪器与试剂。DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义星辰仪器设备有限公司）；DZF-6020-T型智能真空干燥箱（上海丙林电子科技有限公司）；HZK-FA110S电子天平（上海贵虎实业发展有限公司）；RE100B-Pro旋转蒸发仪（上海弘懿仪器设备有限公司）；Waters Quattro Premier XE液质连用仪（杭州携测信息技术有限公司）；Bruker600MHz超导核磁共振仪（CDCl3为溶剂，TMS为内标）。

对硝基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸、3，4-二甲氧苯甲酸、3，4-二甲氧苯乙胺、咖啡酸购自上海麦克林生化科技有限公司；甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸酐、SOCl2、石油醚等试剂均为市售分析纯，购自合肥宝添科贸有限公司；薄层和柱层析用硅胶购自青岛硕远硅胶科技有限公司。

（二）合成方法。

1.乙酰咖啡酸的合成。将醋酸酐(12mL，111.1mmol)加入到一洁净100mL烧杯中，滴加浓硫酸3滴，常温下封口搅拌15min，然后一次性加入咖啡酸(10g，55.6mmol)，继续搅拌至大量白色固体出现，换用玻璃棒继续搅拌30min，FeCl3丙酮溶液检测显示反应完全。加入20mL水，充分搅拌，抽滤，将滤饼转移至100mL烧杯中，滴加饱和Na2CO3至无气泡生成，抽滤，滤饼用10mL水洗涤，合并滤液，往滤液中滴加3mol∕L盐酸至pH=2-3，析出大量白色固体，抽滤，滤饼用水(60mL×3)洗涤，用30%乙醇重结晶，干燥，得白色固体7.1g，收率51.8%。

2.中间体6a的合成[10]。将对硝基苯甲酸(1.3g，7.6mmol)、甲苯25mL、SOCl210mL依次加入到带有尾气吸收回流装置的150mL圆底烧瓶中，升温至80°C反应5h，TLC[V(甲醇)：V(二氯甲烷)=1：10]检测反应基本完全，减压浓缩，并用甲苯(20mL×2)带蒸，得粗品对硝基苯甲酰氯(2a)，用20mL无水CH2Cl2溶解，备用。

将 3，4-二甲氧苯乙胺(1.3g，7.2mmol)、25mL CH2Cl2依次加入到150mL三颈烧瓶中，常温搅拌10min，待3，4-二甲氧苯乙胺充分溶解后，加入NaOH(0.7g，17.5mmol)，冰浴条件下，缓慢滴加二氯甲烷溶解的对硝基苯甲酰氯，约10min滴毕，继续反应 2.0h。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]检测反应基本完全，将反应液转移至分液漏斗，分别用3mol∕L HCl(100mL×2)、饱和Na2CO3(150mL×3)、饱和NaCl(150mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥2h，抽滤，减压浓缩，用无水乙醇重结晶，干燥，得白色固体3a1.8g，收率75.8%。

将3a(1.8g，5.5mmol)、40 mL甲苯依次加入150mL带有回流装置的三颈烧瓶中，搅拌，升温至80°C，待3a全部溶解后，缓慢滴加 POCl3(6.0mL，20mmol)，约 5min滴毕，升温至115°C，反应7小时。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]检测反应基本完全，转移至150mL圆底烧瓶，减压浓缩，冷却至室温，加30mL乙酸乙酯、50mL水充分搅拌，取水层，冰浴条件下，用浓氨水调至pH=9-10，加入50mLCH2Cl2，充分搅拌，转移至分液漏斗静置，取CH2Cl2层，用饱和NaCl(50mL×2)洗涤，无水Na2SO4干燥2 h，抽滤，减压浓缩，得淡黄色油状物4a1.4g，收率82.4%，直接用于下步反应。

将化合物4a(1.4g，4.5mmol)、20mL甲醇依次加入150mL圆底烧瓶中，冰浴下搅拌至4a完全溶解，然后将NaBH4(0.5g，13.5mmol)分5批加入，继续搅拌4h。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]检测反应基本完全，减压浓缩，加入30 mL CH2Cl2，震荡，转移至分液漏斗，用水(50mL×2)洗涤，无水Na2SO4干燥2 h，抽滤，减压浓缩，过硅胶柱，浓缩，用20 mL甲醇溶解，冰浴下滴加浓盐酸，抽滤，滤饼干燥，得白色固体5a1.2g，收率75.9%。

3.目标产物6a的合成。按2a的制备方法，制备乙酰咖啡酰氯二氯甲烷溶液，乙酰咖啡酸的投料量为0.6g(2.3mmol)，二氯甲烷用量为15mL。

将5a(0.8g，2.3mmol)、CH2Cl220mL依次加入150mL三颈烧瓶中，冰浴搅拌下加入Et3N(0.8mL，0.6g，5.7mmol)，待溶液澄清后，将制备的乙酰咖啡酰氯二氯甲烷溶液缓慢滴入，约8min滴毕，继续反应2.5h。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]检测反应基本完全，将反应液转移至分液漏斗，分别用3mol∕L HCl(60mL×2)、饱和Na2CO3(90mL×3)、饱和NaCl(90mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥2h，抽滤，减压浓缩，过硅胶柱，减压浓缩，干燥，得白色固体6a 0.8 g，收率61.5%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.16(d，J=8.4Hz，2H，ArH)，7.74(d，J=15.6Hz，1H，CH=CH-Ar)，7.50(d，J=9.0Hz，2H，ArH)，7.43(dd，J=8.4Hz，J=1.8 Hz，1H，ArH)，7.39(s，1H，ArH)，7.24(d，J=8.4Hz，1H，ArH)，7.02(s，1H，ArH)，6.88(d，J=15.6Hz，1H，CH=CH-Ar)，6.72(s，1H，ArH)，6.55(s，1H，CHN)，4.04-4.01(m，1H，NCH2CH2)，3.92(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，OCH3)，3.49-3.45(m，1H，NCH2CH2)，3.05-3.00(m，1H，NCH2CH2)，2.84-2.81(m，1H，NCH2CH2)，2.33(s，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ：168.20，168.09，165.27，149.56，148.62，148.03，147.27，143.16，142.42，142.12，133.99，129.60，126.48，126.41，125.56，123.91，123.58，122.29，117.93，111.28，110.96，60.42，56.03，55.98，54.91，40.28，28.79，20.68;ESI-Mass：m∕z560.9(M++H)。

通过6a的合成方法制备咖啡酸酰胺类衍生物6b、6c。

6b：白色固体，收率 60.6%，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.70(d，J=15.0 Hz，1H，CH=CH-Ar)，7.43-7.37(m，2H，ArH)，7.23-7.17(m，3H，ArH)，6.97(s，1H，ArH)，6.88-6.81(m，3H，ArH，CH=CH-Ar)，6.68(s，1H，ArH)，6.57(s，1H，CHN)，3.99-3.96(m，1H，NCH2CH2)，3.91(s，3H，OCH3)，3.80(s，6H，OCH3×2)，3.51-3.46(m，1H，NCH2CH2)，3.00-2.97(m，1H，NCH2CH2)，2.81-2.72(m，1H，NCH2CH2)，2.32(s，3H，CH3)，2.31(s，3H，CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ：168.12，164.78，158.93，148.07，147.70，142.93，142.36，141.25，134.67，134.33，130.09，128.81，127.20，126.29，126.24，123.82，122.18，118.70，113.92，113.59，111.23，60.42，55.96，55.92，55.27，39.55，29.05，20.67;ESI-Mass：m∕z 546.0(M++H)。

6c：白色固体，收率 66.5%，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.70(d，J=15.6 Hz，1H，CH=CH-Ar)，7.42(d，J=9.0 Hz，1H，ArH)，7.37(s，1H，ArH)，7.23(d，J=8.4 Hz，1H，ArH)，7.01(s，1H，ArH)，6.96(s，1H，ArH)，6.89(d，J=15.6 Hz，1H，CH=CH-Ar)，6.76(d，J=8.4 Hz，1H，ArH)，6.72(s，1H，ArH)，6.68(s，1H，ArH)，6.58(s，1H，CHN)，3.99-3.96(m，1H，NCH2CH2)，3.91(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.79(s，3H，OCH3)，3.52-3.47(m，1H，NCH2CH2)，3.00-2.97(m，1H，NCH2CH2)，2.82-2.71(m，1H，NCH2CH2)，2.33(s，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ：168.11，165.42，164.85，148.89，148.43，148.09，147.64，142.94，142.37，141.26，135.12，134.30，126.99，126.29，123.84，122.18，121.23，120.10，118.69，112.19，111.29，110.99，110.38，60.42，55.96，55.91，55.87，54.99，39.59，29.07， 20.67;ESI-Mass：m∕z575.9(M++H)。

（三）药理测试[11]。采用细胞株为：肺癌A549细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌HT-29细胞；配制目标化合物和秋水仙碱，使其浓度分别为0μM、0.1μM、1μM、10μM、100 μM、200μM，将对数生长期的A549、MCF-7、HT-29细胞以1×105cells∕孔接种于96孔板，每孔含RPMI1640完全培养基（10%FBS）200μL，置于37℃，5% CO2条件下培养过夜，弃上清液，分别加入配制浓度的6a、6b、6c、秋水仙碱，继续培养72h；在每孔加入50%的TCA固定1小时；用去离子水对每孔进行洗涤，甩干，空气干燥后，加入100μlSRB液，室温染色10分钟，用1%醋酸洗涤（未结合的SRB）或非缓冲Tris碱液洗涤（结合的SRB），空气干燥。细胞振荡仪上振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD540。抑制率=（无药细胞对照孔OD值-用药孔OD值）∕无药细胞对照孔OD值×100%

二、结果

通过检索文献和结合多年工作经验，作者利用药物化学中的生物电子等排原理和拼合原理，设计了3个咖啡酸酰胺类衍生物。以取代苯甲酸和3，4-二甲氧苯乙胺为起始原料，通过酰胺化反应、Bischler-Napieralsk反应、硼氢化钠还原反应合成中间体5a-5c，5a-5c与乙酰化咖啡酰氯通过酰胺化反应，合成3个白色固体目标产物6a-6c，其结构均经MS、1H NMR和13C NMR确证。

3个目标产物6a-6c对A549、MCF-7、HT-29癌细胞的抑制活性通过SRB法进行了检测，结果见表1。

表1 目标化合物对A549、MCF-7、HT-29癌细胞的抑制活性

三、讨论

取代苯甲酸与SOCl2反应制备2a-2c时，回流过程中要观察反应液是否澄清，如果不澄清，需滴加2-3滴DMF，否则产率较低；3a-3c通过Bischler-Napieralsk反应制备4a-4c过程中，滴加POCl3时的温度对此步产率具有较大影响，通过实验摸索发现，滴加POCl3时的温度控制在80-85℃间最佳，温度过低或过高滴加POCl3时，反应过程中均会产生黑色粘稠物，导致4a-4c收率较低；通过实验摸索，发现硼氢化钠的加入量是4a-4c的3倍当量时，收率最高，另外硼氢化钠要在冰浴下缓慢加入，防止液体溅出。

药理活性通过SRB法进行研究，结果显示，6a、6b、6c对A549、MCF-7、HT-29癌细胞均有一定抑制活性，其中6b、6c对A549癌细胞的抑制活性与秋水仙碱相当，6c对MCF-7癌细胞的抑制活性显著优于秋水仙碱，可能在苯环B中引入给电子基团会增加咖啡酸酰胺类衍生物对A549、MCF-7癌细胞的抑制活性，其具体构效关系有待于进一步研究。

四、结语

本文依据生物电子等排原理和拼合原理，设计、合成了3个咖啡酸酰胺类衍生物，药理实验表明，设计、合成的咖啡酸酰胺类衍生物体外对A549、MCF-7、HT-29癌细胞均具有抑制活性。