胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的性能评价

何敏 朱秀霞 柯杰驰 吴静标

【摘要】目的  对广东优尼德生物科技有限公司（优尼德）的脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）的性能进行评价。  方法  对优尼德脂联素试剂盒的空白吸光度、分析灵敏度、线性、准确度和重复性性能进行评价，并用优尼德脂联素试剂盒和Mercodia Adiponection ELISA对110例临床样本进行相关性分析和Bland-Altman一致性分析。  结果  优尼德脂联素试剂盒在0μg/mL～40μg/mL范围内的线性关系良好且相关系数r为0.998 92，准确度水平1和水平2样本的平均相对偏差分别为7.33%和6.83%，重复性水平1和水平2样本的变异系数小于1.62%和1.49%，空白吸光度为0.758 78，分析灵敏度为0.095 9，与Mercodia Adiponection ELISA比对具有良好的相关性。  结论  优尼德脂联素试剂盒空白吸光度小、分析靈敏度高、准确度高、重复性好，与Mercodia Adiponection ELISA进行比对，一致性良好，符合临床实验室要求。

【关键字】 脂联素;胶乳增强免疫比浊法;性能评价

基金项目：典型免疫和分子诊断计量技术、仪器研究及产业公共服务平台建设（20202004071900008）

脂联素（Adiponectin，APN）是一种主要由脂肪细胞分泌的蛋白类激素，属于脂肪因子家族的一员，大量存在于血液循环中，在调节胰岛素敏感性及葡萄糖代谢的过程中起到重要作用，是目前发现的与体脂含量呈负相关的脂类、糖类代谢重要调控因子。大量流行病学调查显示，罹患糖尿病、心血管疾病及相关并发症的患者APN水平远低于健康人群。因此APN在心血管疾病和糖尿病及其综合征等疾病中具有临床应用价值，可以为这些疾病的预防和预后提供参考。

检索国家药品监督管理局国产医疗器械数据库发现，目前国内APN检测试剂盒拥有有效注册证的公司仅有9家，方法学包括基于胶乳增强免疫比浊法、化学发光法、酶联免疫法，其中胶乳增强免疫比浊法占5家。酶联免疫法检测需人工操作、耗时长，不适合单样本检测;化学发光法的虽然灵敏度高，但是其检测需要特定的化学发光仪，成本较高，临床检测中应用范围较小;优尼德的脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）试剂盒配有所需的所有试剂，包括比浊试剂、校准品和质控品，即开即用，不需要额外试剂或提前准备，且适用各种型号的生化分析仪，使用方便。

本研究通过使用广东优尼德生物科技有限公司（以下简称优尼德）的脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）测定临床血清样本中的APN水平，考察该试剂盒的试剂空白吸光度、分析灵敏度、线性、准确度和重复性，全面评价优尼德脂联素试剂盒的性能指标，以期为未来使用脂联素试剂盒进行临床诊断提供指导与性能参考。

1材料和方法

1.1一般资料

参照EP9-A2和《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》，选取2018年1月至2018年12月湖北省新华医院检验科110例糖尿病患者和普通血糖测试者的临床样本，其中男63例，女47例，平均年龄（51.23±16.48）岁。试剂空白吸光度、灵敏度、线性、准确度、重复性试验所用样本为企业参考品。

1.2仪器和试剂

考核系统仪器：全自动生化分析仪（型号：BS380，厂家：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

对照系统仪器：酶标仪（型号：Epoch，厂家：美国BioTek Instruments）。

考核系统试剂：脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）（批号：3610020170821，厂家：优尼德），APN校准品（批号：380520170822，厂家：优尼德），APN质控品（批号：370520170822，厂家：优尼德）。

对照系统试剂：Mercodia Adiponection ELISA（批号：27565，厂家：瑞典Mercodia AB）。

1.3检测方法

1.3.1试剂空白吸光度试验：使用优尼德脂联素测定试剂盒重复测定蒸馏水3次，并记录吸光度A2，A2均值除以100 00即为试剂空白吸光度测定值。

1.3.2灵敏度试验：使用优尼德试剂盒检测10.0μg/mL的脂联素蛋白配制而成的样本，记录测试过程终点吸光度与起始吸光度的差值△A。

1.3.3线性试验：线性范围也是分析范围，指分析方法能直接测定的待测物浓度或质量的范围。稀释高浓度血清样本为从高至低5个梯度的理论浓度（40.0μg/mL、20.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、1.0μg/mL），每个浓度水平检测3次，求均值。以理论浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程。

1.3.4准确度试验：根据美国临床实验室标准化委员会（the National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）EP5-A2对准确度评价的要求，每天使用优尼德脂联素测定试剂盒对水平1样品、水平2样品进行测定，计算标准差、变异系数及相对误差，以评价试剂的准确性。

1.3.5重复性试验：使用优尼德脂联素测定试剂盒分别对两个浓度水平质控品进行测定，每份浓度水平样品重复测定10次，进行批内重复性实验测定，计算均值、标准差和变异系数。

1.3.6方法学比对试验：使用优尼德脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）和Mercodia Adiponection ELISA试剂盒，分别对湖北省新华医院检验科的110例临床标本进行定量分析，作直线回归方程，计算相关系数r，进行相关性分析。

2 结果

2.1 试剂空白吸光度试验结果

优尼德试剂盒试剂的空白吸光度均值为0.758 78。

2.2灵敏度试验结果

优尼德试剂盒试剂的吸光度差值为0.095 9。

2.3线性试验结果

线性的R2=0.997 8，相关系数R=0.998 92，见表1和图1。

2.4准确度试验结果

水平1样本的平均相对偏差为7.33%，水平2样本的平均相对偏差为6.83%，见表2。

2.5重复性试验结果

水平1和水平2的变异系数分别为1.62%和1.49%，见表3。

2.6 方法学比对分析和Bland-Altam分析

对优尼德与Mercodia的检测结果作散点图，得到R2=0.991 3，相关系数 R=0.995 9>0.95，直线回归方程为Y=1.024 3X-0.086 4，试验组与对照组检测结果均具有良好线性关系。见图2。

以试验组与对照组的均值为橫坐标，比值为纵坐标，进行Bland-Altam分析，仅有4/110（3.6%）在95%一致性界限以外，一致性界限为（0.87，1.12），见图3。

3 讨论

脂联素是由apM1基因编码的一种含244个氨基酸的蛋白质，由氨基端非螺旋功能区、N-末端信号肽、胶原样结构域和C-末端的球状结构域组成，脂联素的球状结构域与胶原蛋白VIII和X以及补体因子C1q25蛋白质同源，能促进脂联素与脂联素受体的结合。apM1基因位于人类3q27号染色体上，编码一种由肝脏脂肪细胞所分泌的内源性生物活性蛋白质ADPN。ADPN是一种非常重要的心血管保护因子，在调节能量代谢（比如糖代谢和肪肪代谢）、炎症、抗动脉粥样硬化等起着重要作用，是重要的糖尿病早筛生物标记物。ADPN的N-末端胶原样结构域通过赖氨酸残基的羟基化和糖基化形成脂联素三聚体复合物，脂联素的三聚体通过二硫键结合成六聚体或高分子量脂联素多聚体，这些多聚体是循环脂联素的主要形式，也是脂联素免疫比浊测定试剂盒的检测靶标。目前中山大学孙逸仙纪念医院内分泌科尤丽丽等人使用优尼德的脂联素免疫比浊测定试剂盒成功确立了健康人的血浆脂联素水平的参考范围为男性>3 mg/L，女性>3.4 mg/L 。

作为对照组的Mercodia公司长期专注于代谢紊乱领域尤其是糖尿病和肥胖领域的Elisa临床诊断和科研方面的应用。Mercodia的质量体系由QSR管理，并通过了ISO13485的认证，其产品出口世界上100多个国家。Mecodia的检测试剂盒均使用单克隆抗体（单克隆抗体具有单一的抗原决定簇）和一流的原料，使其试剂盒具有非常高的灵敏度和特异性，可以保证实验的高度重复性。2009年，Mercodia被评为为全球胰岛素检测的最权威机构之一，是WHO推荐的提供金标准方法和产品的权威公司。Mercodia的Elisa法脂联素检测试剂盒作为Mercodia胰岛素检测系列产品广泛被医院所使用。

本研究通过对优尼德脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）的性能指标进行验证，并与瑞典Mercodia的Adiponection ELISA试剂盒进行方法学比对研究，测定结果具有极高的一致性。利用Bland-Altman法作为图形分析法，显示优尼德和Mercodia公司两种检测系统对ADPN测量结果一致性良好，优尼德的检测系统适用于ADPN检测。优尼德的脂联素测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）在脂联素检测上具有样本测试速度快、灵敏度高、准确度、重复性结果良好，试剂稳定性强等诸多优点，可以为相关疾病的临床评价提供精确指导。

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