猪冷冻精液在我国的应用现状和存在的问题

潘红梅 ，彭 刚 ，吴 玲 ，肖杰秋 ，徐 荣

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460;2.重庆市武隆区畜牧发展中心，重庆 408500;3.云南省绥江县动物卫生监督所，云南 绥江 657700)

2009 年起，国家对购买良种猪精液给予补贴，在全国范围内推广猪人工授精技术，种猪常温精液人工授精在我国全面普及。具有一定规模和较强经济实力的社会化公猪站在全国各地建立起来，逐渐形成一个完备的全国种猪常温精液供精网络体系，积极推动了全国猪遗传改良计划的全面实施。各大种猪场间通过优质种公猪精液的交流来建立和增强场间遗传联系和跨群联系。但种猪常温精液保存时间短，保存条件和运输要求高等特点限制了其在远距离交流中的作用，而猪冷冻精液则能有效克服这些限制。冷冻精液能最大限度地存留顶级公猪的遗传材料，为检测人员提供足够的时间检测精液中可能携带的各种病原，有效地提高了精液交流中的生物安全保障。还可以在完成供精种公猪的后裔测定后，再确定是否扩大该公猪精液的配种母猪数，以获得更大的遗传进展。

但猪精子对“冷休克”敏感，使得冷冻和解冻过程中的所有的操作环节都会对精子造成损伤，很难保证精子解冻后质量的稳定性，以致猪冷冻精液在商业化的道路上进展缓慢。

1 猪冷冻精液的发展概述

猪的精液冷冻保存研究始于20 世纪50年代，1966年King等[1]将制作牛冷冻精液的成功方法用来冷冻猪的精液，精子解冻后活力为20%～50%，但解冻精子在37 ℃下存活不到5 h。同时，King将冷冻精液对19头经产母猪和5头初产母猪进行输配，全部返情。直至1970年，Polge 等[2]才通过手术法将猪的冷冻精液直接注入输卵管，首次获得冷冻精液配种生产的仔猪。1年后，Crabo and Einarrsson（1971），Graham（1971）及 Pursel and Johnson（1971） 分别报道通过猪子宫颈人工授精的方法，给母猪输配冷冻精液可令母猪受精[3]。从此，各国科研人员在猪精液冷冻技术及相关领域展开全面研究。

全世界研究者们将各自在猪精液的冷冻保存机理、方法、技术关键环节、冷冻保护剂等方面的研究进展在猪精液冷冻保存国际会议（International Conference on Boar Semen Preservation）上进行交流，至2019年，该国际会议已经召开了 9 次，每一次会议的召开，都积极地推动了猪精液冷冻保存技术的发展。

2 我国早期的猪精液冷冻技术研究回顾

我国对猪精液冷冻技术的研究起步较晚，但发展迅速，成绩显著。从1973年开始在广东、广西等省、区相继开始进行公猪精液冷冻实验。1975年5月12日，广西畜牧所成功获得我国首例冻精配种生产的仔猪，窝产13头，全部成活[4]。截至1976年底广西、广东、陕西等多地已对4 000多头次母猪进行冻精输配，情期受胎率一般在30%～40 %，个别单位达到70 %[5]。1977年成立全国猪精液冷冻技术研究协作组，对冷冻精液的制作、稀释液筛选、冻精解冻程序、冻精质量评价及冻精配种等问题开展研究。据不完全统计，1975-1983年全国各地对21 859头母猪进行冻精输配，平均情期受胎率为56.25%，窝产仔平均为8.18头[6]，其中，杭州市农业科学研究院的冻精受胎率高达82.38%，配种产仔率高达72.95%[7]。

据张继慈的翻译文章中报道[8]，日本6年（1982-1987年）来共使用颗粒冻精输配母猪4 008头，受胎率平均为39.6%，到1987年受胎率平均为49.4%，共产仔1 437窝，平均窝产仔数为8.0头。许怀让的翻译文章中提到[9]，在理想的实验室或实验农场条件下，冻精配种的产仔率可达60 %。在良好环境下，平均产仔率为55%，在典型商业性猪场中产仔率可能低于50 %，而用鲜精（或稀释鲜精）进行人工授精，可获得80%的产仔率。由此可见，我国在猪精液冷冻保存研究的早期，受胎率远远超过日本，在一定程度上与欧美相似，甚至略高于欧美。

我国早期猪精液冷冻技术研究的主要特点是以领导、工人、技术人员相结合，大搞群众运动。当时我国物质资源相当匮乏，不但缺少完成实验研究所需的必要仪器设备，连冻精配种所需的母猪都是极稀少的。在如此艰苦的条件下，能结集全国各地如此多的力量，在短期内完成如此大规模的冻精输配实验，取得举世瞩目的成绩，与政府的支持和相关单位的积极参与和全力投入是分不开的。

3 我国猪精液冷冻技术研究与应用现状

由图1可知，我国在20世纪90年代，对猪精液冷冻保存的研究有一段相对停滞期，这段时间，仅有少数几个研究者在持续开展猪冷冻精液的研究。从2003年以后才重新掀起猪冷冻精液的研究热，至2010年，相关的中文文章发表达到一个高潮，一年内发表文章超过30篇。笔者分析有以下原因：

随着改革开放在我国深入展开，在市场经济指导下的养猪行业发生了天翻地覆的变化。母猪的快繁高产技术成为繁殖学科在养猪上的重点攻关技术。快繁高产技术体系中的重要成员种猪常温精液的人工授精技术迎来发展的春天。国家实施生猪良种补贴政策，直接补贴种猪常温精液，全面推进我国种猪常温精液人工授精技术的普及，人工授精技术水平全面提高。

然而，随着全国猪联合育种工作的开展，常温精液的局限性也显露出来。如场间精液交流的生物安全性、远程精液运输的时效性、顶级种公猪遗传物质的最大限度的利用、地方猪遗传资源的静态保存、夏季常温精液质量差等一系列常温精液不能解决的问题再次呈现在从业者面前。从而，大家再次将目光转移至种猪精液冷冻上来。

当我们都在关注种猪常温精液的人工授精技术时，欧美国家并未停止冷冻精液的研究。他们研究了用塑料细管作为冷冻精液的载体，同时开发了程序化冷冻设备及相应的计算机辅助精液质量检测系统。借助先进的精液冷冻设备，美国和加拿大向世界各国出售其优质种猪冷冻精液。至此，我国开始从国外引进生产冷冻精液的设备、技术及种猪冷冻精液，开启了边研究边引进的猪冷冻精液发展进程。随着冷冻精液专用设备的研发和配套的猪人工授精技术的进步，猪精液冷冻研究与应用在我国发展迅速。近年来，国内百钧达、北京田园奥瑞等公司相继研发了猪精液冷冻保存技术，自主开发冷冻保护剂和精液冷冻设备，并在全国范围内开始猪冷冻精液的商业化生产、销售[10]。广东温氏、上海祥欣等国内知名育种企业已相继建立猪冷冻精液商业化生产平台，能为国内外客户提供优质遗传资源，并为客户提供配套的人工授精技术指导。表1中列出近20年我国部分猪场种猪冷冻精液应用情况。

表1 近20年我国部分猪场种猪冷冻精液应用情况表

由表1可知，近20年来，我国猪冷冻精液技术发展迅速，进展喜人。尤其是商业化的应用开发团队百均达、田园奥瑞的掘起，加速种猪冷冻精液的质量提升，不论在配种受胎率还是窝产活仔数上都相比早期的颗粒冻精时代有了质的飞跃。同时，对比国产猪冻精和国外引进猪冻精的配种产仔成绩不难发现，国产冻精配种的的受胎率、配种分娩率及窝产活仔数均已远超国外引进冻精。尤其是海南罗牛山的冻精，竟达到100%的配种分娩率，而重庆农投2016年从英国引进的冻精配种分娩率仅达11.11%，且窝产活仔数只有4头。笔者所在的团队也对百均达的冻精和加拿大的冻精配种结果作了比较，配种结果表明，百均达冻精配种分娩率为57.81%，窝产活仔数8.3头；加拿大引进冻精配种分娩率40.54%，窝产活仔数8.53头（数据未发表），国产冻精配种成绩优于加拿大引进冻精。

4 存在的问题

尽管目前我国猪冷冻精液质量已提高到世界先进水平，商业化应用逐渐扩大，但猪冷冻精液要完全实现商业化应用仍有很长的路要走。

4.1 猪精液冷冻损伤的机理研究不足，无法从根本上解决猪精子耐冻性差的问题

精子的冷冻损伤包括物理损伤、化学损伤和自身氧化损伤3类，这些损伤贯穿整个冷冻-解冻过程。目前，在冷冻程序上，通过程序降温仪可有效控制降温速度和解冻速度，在一定程度上可有效降低物理冰晶对精子的损伤；而冷冻保护剂的不断改进，冷冻过程中的精子受到的化学性损伤也在逐渐改善。但是，在冷冻降温过程中，精子细胞内会产生大量活性氧（ROS），过量的ROS在细胞内堆积，引发精子膜上的多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应，产生大量脂类过氧化物，导致精子质膜破损，DNA链断裂，核染色质损伤，精子呼吸被抑制，蛋白质氧化损伤等[22]。由于猪精子膜上的不饱和脂类含量较其他物种高，更容易发生氧化反应，导致猪精子冷冻质量低下，因此氧化性损伤对猪精液冷冻影响更大。

近年来，蛋白组学研究已发展成生命科学领域的新技术，蛋白表达的检测、蛋白间相互作用的检测等技术被广泛应用。将蛋白组学的研究方法用于精子损伤机理，尤其是冷冻过程中大分子蛋白质损伤的研究，有望进一步揭示精子冷冻损伤的机理及提高精子的冷冻保存效率，加速推动猪精液冷冻保存技术进展。

4.2 猪精子对温度的变化敏感，温控设备价格昂贵

猪精液冷冻工艺流程中基本上有 11 个技术环节涉及到温度条件：原精液活力检测→原精液稀释、自然降至室温→转入恒温箱（17 ℃）中恒温保存→17℃ 环境条件离心→弃上清液、等温添加无甘油稀释液→置低温柜（3～5 ℃）降温、平衡→平衡温度下添加含甘油稀释液→平衡温度下封装细管精液→置入冷冻程序仪器进行精液冷冻→细管冻精分装保存→细管冻精解冻→解冻后精子活率质量检测分析。在这个工艺流程中涉及的温控设备有空调、显微镜恒温台、17℃恒温箱、温控离心机、4℃低温操作柜、程序冷冻仪、细管分装仪、恒温水浴锅等。配齐一套完整的设备，需要配备专门的实验室，且设备采购费用高昂，一般养猪企业难以实现。少数企业或单位具备冷冻精液的制作条件，也限制了猪冷冻精液在实际生产中的推广应用。

4.3 适合制作冷冻精液公猪的筛选

徐章龙[7]在1980年对23头公猪精液耐冻性测试中，发现猪只个体间精液耐冻性差异很大，不同个体的冻精受胎率也有差异。他认为有必要测试公猪原精液的各项指标和耐冻性，而且解冻后的活力并不表示受胎率，要想提高猪冷冻精液的质量和受胎率，需要对供精公猪精子的耐冻性和受胎率进行检测。但时至今日，40年时间过去，关于供精公猪精子耐冻性检测和精子受胎能力检测的问题依然没有解决。目前仍采用大量的冷冻实验来筛选耐冻精子的供应体，而冻精受胎能力则需要对其多次配种结果分析才能获得。这些方法工作量大，耗时长，不适应商业化生产要求。希望在以后的研究中能找到相关的差异基因，研制出有效检测试剂盒，以提高冻精公猪的选择能力，扩大冷冻精液的生产量。

4.4 不同饲养管理条件的猪场配种产仔成绩差异显著

据陈献欣[17]报道，广西农垦永新畜牧集团有限公司于2016年分别在传统饲养方式和全程空气过滤模式的两种猪场，开展冷冻精液配种试验，将加拿大引进的精液在传统场输配母猪51头，配种产仔率49.02%，窝产活仔数7.48头；在全程空气过滤场输配母猪99头，配种产仔率69.70%，窝产活仔数7.81头。上海祥欣[18]采用百均达的冻精在国家生猪核心育种场配种，配种分娩率高过80.87%，窝产活仔数高达9.75头；而笔者采用百均达冻精在小规模商品猪养殖场配种，配种分娩率为57.81%，窝产活仔数8.3头（数据未发表）。由此可见，冷冻精液配种产仔成绩与猪场的饲养管理条件密切相关。对大多数硬件条件不过硬，饲养管理水平不够高的猪场，冷冻精液要达到普通常温精液的生产成绩，还有很长的路要走。

4.5 对母猪的胎次和健康状况要求高，不被普通猪场接受

从几十年冻精配种经验得知，采用冷冻精液配种对母猪的胎次和健康状况要求都很高。一般要选择3～5胎的经产母猪，且要求这些母猪在断奶后4～6 d能正常发情。这样的母猪冻配后才能获得较高的受胎率和窝产仔数。但在实际生产中，这类母猪在普通条件的猪场是提高生产成绩的中坚力量，通常采用常温精液配种，它们的受胎率能达到90%以上，窝产活仔数超过12头。如此大的差距，是普通生产场所不能接受的。因此，冷冻精液在全国范围内大面积推广，还很困难。

4.6 配种时间的掌握要求精准，对配种员技术水平要求高

虽然商业售卖的猪冷冻精液解冻和稀释后仍具有较高的活力，但精子在冷冻-解冻过程中均遭受到不同程度的损伤，导致它在母猪生殖道的获能存活时间大大缩短，致使受胎率、配种产仔率及产活仔数等繁殖指标明显低于液态保存精液。

做好母猪的发情鉴定，准确判断母猪的排卵时间，把握好准确的输精时间至关重要。对配种员的发情鉴定技术和深部输精技术要求更高。有专家提出冷冻精液的理想受精时间往往在母猪排卵前的4～6 h范围内，使用冻精配种的猪场应把母猪的发情鉴定次数由原来的2次/d增加到 3次/d(即早上5:00，中午13:00，晚上21:00)，以提高冻配母猪的受胎率和窝产仔数。

4.7 冷冻精液质量稳定性差，每次输配总精子数不好把握

猪冷冻精液作为一种特殊的生物产品，其质量影响因素诸多，质量极易出现波动，精液冷冻过程中任何一个关键技术环节上的失误可导致全过程的失败。即使来自同一头供体公猪的精液由同一个人冻存，不同采精批次，不同的人解冻操作，都会出现差异性的结果。面对这种情况，在精液解冻后，输配前质量评定及输配精液数量的把握至关重要。前人的研究结果表明，冻精输精时，有效精子数量越多，配种产仔率和受胎率越高。

4.8 缺少相关的技术标准，很难对冻精质量进行标准化评价

2017年河北省颁发《猪冷冻精液》（DB13/T 2633-2017）的地方标准，这是我国第1个关于猪冷冻精液产品要求的标准。目前，全国多个地区或单位均在开展猪冷冻精液标准的起草和研究。但与精子运动能力和受精能力密切相关的质膜、顶体、线粒体膜等直接关系精子受精能力的质量指标至今没有好的检测方法。我们还需要继续加强对冷冻精子质量评价方法的研究，并在相关检测单位和检测人员中进行试用和调研。制订出操作简便，重复性好的评价方法，能客观评定冻精质量的标准，是我们在实际生产中推广冻精，有效监督的前提。

5 结论

随着猪人工授精技术的发展，公母猪配种比例从1∶20的本交，发展到1∶200或1∶300的普通常温精液输精，再到1∶400的低剂量输精技术，在减少种公猪饲养数量的同时，更大程度地发挥优质公猪的遗传潜力。而冷冻精液配合深部输精技术可以将优质公猪的配种比例增加到1∶1 000，可以实现优良基因的最大化利用。未来我国生猪改良计划的实现，需要优质种公猪的冷冻精液参与，而优质冷冻精液的应用和推广需要全国上下同心，共同努力才能实现。

在政府层面上，我们需要政府的资金和政策的支持。我国在20世纪70年代启动的猪冷冻精液研究在各级政府的大力支持下，全国几十个科研院所联合攻关，在短短十多年的时间里，取得举世瞩目的重大成绩。但自此以后，猪的冷冻精液研究进展总是断断续续，上到国家、下到基层科研院所，极少有相关的项目支持，基本都是感兴趣的学者和企业在小范围内独自研究。如果国家能给予持续的政策和经费的支持，猪的精液冷冻保存技术应该会有一个新的提升。

科研院所方面，需要加大人力投入，从冷冻机理、冷冻保护剂的开发、冷冻技术、程序设计等方面对现有技术进行系统梳理，提出其中的难点、可攻克点，有针对性地逐项研究攻关，形成应用于生产的技术规范，努力提高猪冷冻精液冷冻-解冻后的配种成绩。

养猪企业方面，配合科研院所的新技术应用研究与推广，提供种公猪精液材料和种猪选育资料，力争将遗传性能测定后的优秀公猪精液用于制作冻精，最大限度发挥优质公猪的遗传潜力。同时，借助国家生猪交易平台，将冷冻精液的可溯源产品信息发布出来，在平台上公开。

总之，我们目前在猪冷冻精液方面的产学研几条线各自为政，相互间的关联严重脱节。希望政府能给予支持，倡导相关行业联动起来，共同促进种猪冷冻精液的质量提升和标准化、商业化应用。