嗜热链球菌S10发酵乳贮藏期间的代谢组学研究

李丹阳 郑 岩 张文羿 孙天松

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室呼和浩特010018）

发酵乳是乳酸菌应用最早，也是最为人们熟知的发酵产品。随着人们对健康的日益重视，发酵乳作为优质蛋白质、钙、磷、钾及多种维生素来源的饮品，其销量呈突飞猛进之势。然而，其贮藏期短（市售发酵乳的贮藏期为21 d），后发酵期产酸过多，感官品质变差等成为限制其大量销售的主要原因之一[1]。造成这一现象的根本原因是乳酸菌在4 ℃贮藏过程中仍保持一定的活力，随着乳酸菌的生长与繁殖，发酵乳发生一系列生化反应，导致发酵乳的感官质量、风味品质受到一定程度的影响[2]。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白组学之后新兴的一门组学技术，比传统单一指标的检验分析方法更具系统性[3]。与其它组学相比，代谢组学的优势在于基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物上放大，此外，代谢组学所采用的技术手段也更为通用[4]。Dettmer 等[5]将不同组学的研究内容总结为“基因组学告诉我们能够发生什么，转录组学告诉我们将要发生什么，代谢组学告诉我们发生了什么或什么正在发生”。代谢组学作为一个最新的“组学”学科之一，是系统生物学中最有意义的研究领域，也是目前组学领域研究的热点之一，特别是在食品与营养科学中的应用逐渐深入。依据代谢特性来评价发酵乳的品质可以作为研究的一个创新点，从代谢产物层面研究贮藏过程中发生了哪些生化反应，可为工业化生产及产品品质的控制提供有效依据。

嗜热链球菌（S.thermophilus）S10 是一株从青海自然发酵酸牛乳中分离出的菌株，具有产酸、产黏、产香等优良发酵特性。本试验选用嗜热链球菌S10 作为发酵菌株，采集贮藏不同时间的发酵乳，利用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术结合主成分分析 （PCA，Principal Components Analysis）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA，Orthogonal Partial Least Square-Discriminate Analysis） 研究发酵乳在贮藏期间的代谢特性，从代谢角度评估该菌株发酵乳贮藏期间的品质，为嗜热链球菌S10 产业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验菌株嗜热链球菌S10 由乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。乙腈（色谱级）、甲酸（色谱级）、氨水（色谱级），Sigema 公司。

亮氨酸脑啡肽 （Leucine-enkephalin）、ACQUITY UPLC-Xevo G2 QTOF MS 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪、MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 软件，Waters 公司；Milli-Q 纯水仪，Millipore 公司。

1.2 嗜热链球菌S10 发酵乳的制备

市售鲜奶，加入8%蔗糖，高压均质，95 ℃灭菌10 min，嗜热链球菌S10 以5×106CFU/mL 接种量接种于已灭菌的鲜奶中，42 ℃恒温培养至发酵终点（pH 4.5），置4 ℃冰箱贮藏。

1.3 嗜热链球菌S10 发酵乳贮藏期间pH 值和滴定酸度的测定

采集贮藏不同时间的发酵乳样品，pH 值测定采用精密pH 计测定。滴定酸度测定根据国家标准GB5409-85，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定法测定[6]。

1.4 UPLC-Q-TOF MS 分析

1.4.1 样品前处理 采集的样品经12 000×g 离心15 min，弃脂肪层，吸取1 mL 上清液于新EP管，加入7 mL 乙腈溶液混匀，4 ℃静置2 h，12 000×g 离心10 min（去除大分子蛋白质），吸取上清液，旋转蒸发浓缩10 h，加40%乙腈溶液复溶，用0.22 μm 微孔滤膜过滤。

1.4.2 高效液相色谱条件 选用Waters BEH C18 色谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温35℃，流速0.3 mL/min，进样量5 μL。液相采用反向UPLC 系统及梯度洗脱模式（流动相为乙腈、水），正离子模式流动相：0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱条件见表1。负离子模式流动相组：0.1%甲酸铵溶液和乙腈溶液，梯度洗脱条件见表2。

1.4.3 质谱条件 质谱采用ESI 源正离子（ESI+）与负离子（ESI-）模式扫描，质荷比扫描范围50～1 000 m/z。为确保数据的准确性和重现性，在正离子模式下采用浓度为200 ng/μL 的亮氨酸脑啡肽（556.2771 u）为校正液，在负离子模式下，采用浓度为200 ng/μL 的亮氨酸脑啡肽（554.2615 u）为校正液。毛细管电压3.0 kV，样品锥孔电压40 kV，源温100 ℃，去溶剂气温度450 ℃，锥孔气流速50 h/L，脱溶剂气流速600 h/L。

1.5 数据处理和统计学分析

UPLC-QTOF MS 获得的原始数据经MassLynx 4.1 工作站、Progenesis QI 软件完成峰提取、峰对齐、去卷积化等处理，将以上数据文件导入EZinfo 软件进行多维统计分析，包括主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析等。采用OPLS-DA模型的变量投影重要性 （VIP，Variable importance in the projection） 大于1 和单维统计分析（正态分布数据采用双尾学生氏t 检验和非正态分布数据采用Wilcoxon Mann-Whitney 检验）的P值小于0.05 相结合的方法筛选差异性代谢物。

1.6 代谢物结构鉴定与代谢通路分析

筛选出差异代谢物后，根据物质的保留时间和质荷比，通过Chemspider、KEGG、METLIN 等多个代谢组数据库检索，得到的差异代谢物经二级质谱碎片信息匹配完成鉴定，结合KEGG 数据库进行代谢通路分析。

2 结果与讨论

2.1 嗜热链球菌S10 发酵乳贮藏期间的pH 值和滴定酸度

由表3可知，嗜热链球菌S10 发酵乳在4 ℃21 d 贮藏期间，随着贮藏时间的增加，pH 值逐渐降低，滴定酸度反而上升。其中0～7 d 的变化最大，之后逐渐减小。在贮藏过程中pH 值呈降低趋势，这是由于嗜热链球菌S10 在低温贮藏条件下继续发酵产酸，pH 值持续下降导致发酵乳后酸化现象，对发酵乳的品质产生一定的影响[7]。秦艳婷等[8]研究了21 株嗜热链球菌的贮藏特性，结果表明：在 贮 藏48 h 内，菌 株IMAU20764 和IMAU20246 发酵乳的pH 值变化较大（分别下降了0.18 和0.11）。李宏军等[9]研究了不同贮藏条件下发酵乳的pH 值和滴定酸度的变化，结果显示：在4 ℃条件下贮藏时，滴定酸度和pH 值的变化在第1 周较大，随后变小，与本试验结果基本一致。

2.2 嗜热链球菌S10 发酵乳贮藏期间的代谢组学分析

采用UPLC-QTOF MS 联用技术对贮藏0，1，7，14，21 d 的发酵乳样品进行代谢组学分析。正负离子模式下贮藏0 d 与21 d 样本基峰强度如图1所示。可以看出，贮藏0 d 与21 d 的样品基峰有明显差异。正离子模式下的差别出现在4 min 后，与贮藏21 d 的样品相比，贮藏0 d 样品中4～8 min的物质随贮藏时间的增加而减少，与之相反，8 min 后的物质随贮藏时间的增加而增多；负离子模式下的差别始终存在。综上所述，贮藏21 d 的样品与贮藏0 d 的样品在代谢物方面差异显著。

为了找到差异代谢物质，通过Ezinfo 监督模式的OPLS-DA 对贮藏不同时间的样品进行分析，结果如图2所示。0 d 样品组内间距较小，在PLS得分图中分布比较集中，即0 d 样品代谢物没有发生改变，重复性较高。贮藏0 d 样品与其它贮藏时间样品之间的距离较大，即样本间出现最大程度的分离，说明随着贮藏时间的增加，样本中的代谢物发生了改变。通过OPLS-DA 模型的得分图 （S-PLOT，Scores Plot）选择VIP 值大于1 且距离原点较远的变量，距离原点的距离越远，对各个样品分类所起作用越大。将筛选出贡献较大且具有显著性差异的离子作为差异代谢物，结果见图3。

图1 发酵乳贮藏期间的基峰强度图Fig.1 Based peak intensity（BPI） chromatograms of fermented milk during storage

图2 发酵乳贮藏期间正交偏最小二乘法-判别分析模型Fig.2 OPLS-DA of fermented milk during storage

图3 发酵乳贮藏期间得分图Fig.3 S-PLOTS of fermented milk during storage

2.3 代谢物鉴定和分析结果

差异代谢物的鉴定方法为通过一级质谱信息确定相对分子质量，同位素匹配度越好，质量偏差越小的化合物为正确化合物的可能性越大[10]。根据化合物的精确质核比利用Chemspider、KEGG、METLIN 等多个数据库检索，在1 ppm 的差异范围选出候选物，通过二级质谱得到物质的碎片信息，匹配各项信息，共推断得到22 个差异代谢物，见表4。

由表4可知，发酵乳贮藏期间代谢物的变化主要与碳水化合物及能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢及嘌呤代谢等多条代谢途径相关，其中一些主要的代谢物变化如下：

1）甘油磷脂、油酸等参与脂质代谢的代谢物有所增加。甘油磷脂代谢是脂质代谢中发生变化的主要代谢途径，具有一定的代谢网络。由于代谢产物的复杂性与多样性，脂质代谢也被作为代谢组学的一个重要分支，逐渐成为近几年科研研究的重点[11]。Hermansson 等[12]绘制了所有哺乳细胞中都存在的甘油磷脂的生物合成和代谢途径，为脂质代谢的研究提供了理论依据。根据1984年Rao等[13]的研究，用嗜热链球菌发酵全脂乳，结果会对乳脂产生影响，包括饱和脂肪酸和游离脂肪酸有所增加，其中最重要的是硬脂酸和油酸的含量有所增加。油酸和硬脂酸对软化血管有一定的功效，且在人体的新陈代谢中起着是很重要的作用，因而油酸的增加更有益于健康。

表4 发酵乳贮藏期间差异代谢物Table 4 The differential metabolites of fermented milk during storage

2）烟酸有所增加，色氨酸有所减少。烟酸（又名尼克酸）和烟酰胺是维生素PP 中的一种，其主要作用是通过抑制甘油三酯脂肪酶来减少脂肪组织中的脂解[14]。根据现有研究结果可知，酸乳发酵过程中嗜热链球菌可以合成尼克酸和叶酸，尼克酸是在合成NAD 和NADP 的过程中产生的，嗜热链球菌通过消耗色氨酸而合成尼克酸，因而在过程中出现色氨酸的减少[15]。酸乳在4 ℃贮藏过程中会出现一些维生素含量减少，包括生物素和泛酸。这是由于培养过程中微生物代谢以及冷藏过程中维生素的化学分解所造成的，后者已用直接酸化法证实为更主要的原因[16]。

3）嘌呤减少，甘氨酸增加。嘌呤是细胞中最丰富的代谢物种，对于提供细胞能量及细胞内信号传导起着十分重要的作用。嗜热链球菌可以分解嘌呤和嘧啶作为生长的碳源、氮源和能源，在分解腺嘌呤过程中，腺嘌呤被腺嘌呤脱氨酶分解为次黄嘌呤，进一步被分解为黄嘌呤，黄嘌呤形成后经一系列的转化最后生成甘氨酸[16]。

4）L-赖氨酰-N-甲基-L-缬氨酰、甘氨酰-L-脯氨酸等短肽代谢物增加。甘氨酸、L-谷氨酸等氨基酸在贮藏过程中也发生变化，这是因为嗜热链球菌利用蛋白质并将其分解为大小不等的多肽或氨基酸等小分子化合物进入细胞[17]。有研究表明，短肽具有一定的生理活性，包括抗氧化、降血糖等作用[18]。王越男等[19]对凝固型发酵乳的代谢图谱研究发现，Lys-Glu-Ser-Thr-Leu、Ala-Ala-Pro-Thr、Leu-Lys-Leu 和Leu-Lys-Leu 等短肽类代谢物显著增加，与本试验结果一致。Ghosh 等[20]研究嗜热链球菌和植物乳杆菌混合发酵牛乳发现，发酵乳中的蛋白降解为大量的短肽和氨基酸，这些短肽具有一定的生物活性。谷氨酸含量有所降低，则是由于在谷氨酸脱氢酶（GDH）的作用下，转氨酶与谷氨酸结合，催化了酮α-戊二酸的脱氨基作用。瞿爽[21]研究发现，嗜热链球菌对天冬氨酸、谷氨酸等消耗量较大，与本试验结果一致。现有的LAB基因组检测结果显示，GDH 编码基因存在于一些菌株中，包括嗜热链球菌、植物乳杆菌，而其它菌如乳酸乳球菌、干酪乳杆菌中则没有。

5）琥珀酸、草酰乙酸等物质有所增加。嗜热链球菌属兼性厌氧菌，在厌氧条件下因缺乏丙酮酸脱氢酶系和α-戊酮二酸脱氢酶体系而不能形成完整的TCA 循环，然而，为了保证生物合成所需的前体物质，TCA 循环被改为两条支路，其中还原支路可在厌氧条件下发生[22]。还原支路由草酰乙酸还原为琥珀酸，催化延胡索酸还原为琥珀酸的酶不是琥珀酸脱氢酶而是延胡索酸还原酶（FR），此酶是厌氧条件下形成琥珀酸的关键酶，因而琥珀酸、草酰乙酸等物质都有所增加。Azizan等[23]利用GC-MS 方法研究不同条件下培养乳酸菌的代谢产物，发现除各种氨基酸外，参与TCA循环的琥珀酸、苹果酸和柠檬酸等有机酸的数量显著增加。此外，链球菌在葡萄糖限制性条件下，从终产物中可以检测到甲酸、乙酸等产物，这主要是由不同的发酵途径所产生。

草酰乙酸、琥珀酸、甘氨酸、L-谷氨酸等差异物质多属于初级代谢物，通过初级代谢，使营养物转化为具有生理活性的物质，为微生物的生长提供能量，这些物质是机体生存必不可少的。有研究表明，乳中初级代谢物的变化与营养质量相关，不会对发酵乳的品质产生不利影响[24]。

3 结论

本试验通过UPLC-QTOF MS 技术与正交偏最小二乘法-判别分析，结合数据库检索及质谱信息匹配，筛选出甘氨酰-L-脯氨酸、琥珀酸、甘氨酸、L-谷氨酸、烟酸等22 个生物标志物，涉及碳水化合物及能量代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等多条代谢途径。在嗜热链球菌S10 发酵乳贮藏期间差异代谢物多是初级代谢产物，其种类和含量不会对发酵乳的品质产生不利影响。