超高压均质处理的米糠膳食纤维粉对面筋蛋白结构的影响

谢凤英 赵玉莹 雷宇宸 韩 雪 任宇涵 卢仙玉 吴 瑕*

（1 东北农业大学食品学院 哈尔滨150030 2 中国海洋大学食品科学与工程学院 山东青岛266100）

米糠是稻谷加工中的副产物，其年产量在1 200 万t 左右，具有很高的开发价值。膳食纤维在米糠中的含量为27%，其可以减缓胃排空，与无机盐结合于肠道内形成不可吸收的复合物，进而对Ⅱ型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等疾病起到很好的预防作用[1-4]。

以传统面制品为载体，以米糠膳食纤维为添加物，已成为面制品营养保健功能提高的有效手段。当膳食纤维添加于面制品中时，随着添加量的增加，面团流变学性质和面制品品质都会发生相应变化。学者们认为这种变化是膳食纤维的加入阻碍了面筋蛋白网络结构的形成，同时又与面粉中的淀粉、蛋白质等成分竞争水分子，进而导致面团中水分重新分布，面筋蛋白脱水，结构塌陷这一结果[5-7]。为了保证面团流变学特性和面制品品质，谷物膳食纤维添加量通常控制在6%～10%[8-9]。超高压均质技术是一种可用于液-液、固-液处理的高新技术，通过高压作用促使物料发生物理、化学、结构性质等一系列变化，最终达到纳米级均质的目的。近年来该技术在颗粒微细化方面也有应用。例如，Liu C 等[10]利用超高压均质对豆渣中不溶性膳食纤维进行改性，将其添加于大米淀粉糊时其糊化和流变学特性均有所改善。此外，面筋蛋白结构分析的方法有核磁共振（NMR）、圆二色谱法（CD）、紫外光谱、X 射线衍射（X-ray）和红外光谱（FTIR）等，其中FTIR 因不受蛋白质状态、官能团、浓度、分子质量、环境等条件的限制，样品用量少，操作简便，直接、快速而成为蛋白质结构分析的常用检测技术[11-12]。

本试验中通过超高压均质处理来改善米糠膳食纤维口感粗糙、食用性差这一缺点，采用红外光谱法分析米糠膳食纤维粉不同添加量的面筋蛋白结构，以此明确米糠膳食纤维在面粉中的添加比例，为米糠的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠，黑龙江省五谷信合生态农业开发有限公司；中筋面粉，河北五得利面粉集团有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg），上海源叶生物科技有限公司；石油醚、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯级。

1.2 设备与仪器

摇摆式高速中药粉碎机（DFY-500 型500 g），浙江温岭市大德中药机械有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9146A 型），上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水浴锅（DK-98-1 型），余姚市东方电工仪器厂；低速离心机（SC-3614），安徽中科中佳科学仪器有限公司；面筋洗涤仪（ST007B），济南盛泰仪器有限公司；超高压均质机（FB-110T），上海励途机械设备工程有限公司；雷磁pH 计（HS-3C），上海精密科学仪器有限公司；粒度仪（Mastersizer 2000），英国马尔文仪器有限公司；扫描电子显微镜（S-570 型），日本日立公司；傅里叶变换红外光谱仪 （Spectrum GX 型），美国PerkinElmer 公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠膳食纤维的制备 原料米糠经洗涤、干燥、粉碎、筛分、石油醚脱脂后，按照料液比1∶6加入蒸馏水。调节pH 值为6.5，加入α-淀粉酶（2.0 g/100 mL），于60 ℃水浴加热的条件下酶解2.0 h；调节pH 值为10.0，加入碱性蛋白酶（2.0 g/100 mL），于45 ℃水浴加热的条件下酶解2.0 h，加热灭酶（90 ℃，10.0 min），用蒸馏水反复洗涤3 次，离心（4 500 r/min，10.0 min）得沉淀物，低温干燥得米糠膳食纤维。

1.3.2 米糠膳食纤维的超高压均质处理 取1.3.1节制备的米糠膳食纤维，按料液比1∶20 加入蒸馏水混匀，进行均质处理。其处理条件为：均质压力120 MPa，3 个处理循环，每个循环30 s。其后，60℃低温干燥得米糠膳食纤维粉。

1.3.3 面团的制作及其面筋蛋白的提取 参考王世新等[13]的方法。将米糠膳食纤维粉按0%，5.0%，10.0%，15.0%，20.0%的比例添加于面粉中至终质量为100 g，加水搅拌，和面，将和好的面团置于2.0% NaCI 溶液中静置20 min，用面筋洗涤仪洗至清洗液清澈透明。将湿面筋置于恒温干燥箱中，于40 ℃温度条件下烘干，粉碎、筛分，即面筋蛋白成品。

1.3.4 米糠膳食纤维粉粒径的测定 采用Mastersizer 2000 粒度仪测定脱脂米糠和米糠膳食纤维粉的粒径。

1.3.5 米糠膳食纤维粉微观结构的观察 参考Zhang M 等[14]的方法，将脱脂米糠和米糠膳食纤维粉置于载物片上进行喷金固定处理，在5 kV 加速电压下对样品的微观结构进行电子显微镜观察。

1.3.6 面筋蛋白的FTIR 采集及谱图处理 采用KBr 压片法获得面筋蛋白的红外图谱，其仪器操作条件参考杜鹃等[15]的方法。图谱处理：采用Originpro9.1 软件处理面筋蛋白的红外光谱数据，选取酰胺Ⅰ带（1 600～1 700 cm-1）为蛋白二级结构分析谱带区域。采用PeakFi t v4.12 软件对截取的波段进行基线校正、Deconvolve Gaussian IRF 去卷积、二阶导数拟合，得到各子峰所占面积百分比。依据子峰与二级结构对应关系进行加和，得到其二级结构所占比例。

2 结果与分析

2.1 米糠膳食纤维粉粒径

粒径是反映物料颗粒大小的重要指标[16]。经超高压均质处理后米糠膳食纤维粉粒径测定结果见表1。米糠膳食纤维粉粒度为纳米级，其体积平均粒径为244.25～261.95 nm。可见，超高压均质处理后米糠膳食纤维粉粒径分布范围较窄，接近于高斯分布[17]，说明超高压均质处理可以很好地改善米糠膳食纤维粉体的均匀性。

表1 米糠膳食纤维粉的粒径分布Table 1 Size distribution of rice bran dietary fiber powder

2.2 米糠膳食纤维粉微观结构

脱脂米糠和超高压均质处理的米糠膳食纤维粉的扫描电子显微镜图见图1。可以看出，脱脂米糠（图a 和b）原料中除了片状纤维结构外，还含有粒状颗粒和光滑球状物，其主要为淀粉或蛋白质分子。经超高压均质处理的米糠膳食纤维粉（图c 和d）的微观结构发生较大改变，未见淀粉和蛋白质分子颗粒，膳食纤维由大片状的紧密型转变为由小颗粒、不规则的片状物组成的松散型结构。由此可见，超高压均质处理产生的剪切力促使膳食纤维分子链发生断裂，聚合度降低。

图1 脱脂米糠和米糠膳食纤维粉的扫描电子显微镜图Fig.1 Scanning electron microscopy of defatted rice bran and rice bran dietary fiber powder

2.3 面筋蛋白的FTIR 图谱分析

米糠膳食纤维不同添加量的面筋蛋白结构变化的红外光谱见图1，其吸收峰所对应的官能团谱带归属见表2。由图1和表2可知，在3 650～3 200，1 700～1 620，1 330～1 200 cm-1和990～1 160 cm-1范围均出现蛋白质的特征吸收峰。与空白组（膳食纤维添加量为0%）相比，添加米糠膳食纤维的面筋蛋白FTIR 光谱的谱带半峰宽、强度均发生不同程度的变化。可见，添加米糠膳食纤维粉使面筋蛋白二级结构发生了改变。

图2 米糠膳食纤维粉不同添加量的面筋蛋白FTIR 图谱Fig.2 The gluten protein FTIR spectra of rice bran dietary fiber different additions

表2 FTIR 特征峰及其谱带归属[18～20]Table 2 Infrared characteristic peaks and their band assignments[18～20]

2.4 面筋蛋白二级结构

在蛋白质的红外光谱图中，酰胺I 带主要由蛋白质二级结构的红外吸收子峰叠加而成，为蛋白质二级结构变化的敏感区域。为此，选择酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）谱图，经基线校正、高斯去卷积、二阶导数拟合处理分离出米糠膳食纤维粉添加量分别为0%，5.0%，10.0%，15.0%和20.0%时面筋蛋白质二级结构的定性、定量信息。对酰胺I 带中各子峰进行如下归属：1 610～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1为β-折叠结构；1 646～1 664 cm-1为α-螺旋结构；1 637～1 645 cm-1为无规则卷曲结构；1 664～1 681 cm-1为β-转角结构[22]。米糠膳食纤维粉不同添加量的面筋蛋白酰胺I 带拟合曲线如图2所示。以其为依据，对不同米糠膳食纤维粉添加量面筋蛋白质酰胺I 带波数二级结构指认如表3所示。其面筋蛋白质二级结构α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构的百分含量如表4所示。

图3 米糠膳食纤维粉不同添加量的面筋蛋白去卷积酰胺I 带二阶导数拟合图谱Fig.3 Second-derivative FTIR spectra of gluten protein added to rice bran dietary fiber in the amide I region and Gaussian curve fitting

由图3和表4可知，面筋蛋白的二级结构以α-螺旋和β-折叠为主，相对含量分别为27.55%和40.49%，而β-转角和无规则卷曲所占的比例较小，分别为17.68%和14.28%。米糠膳食纤维粉的添加对面筋蛋白二级结构的影响为α-螺旋、β-转角和无规则卷曲含量减少，而β-折叠含量增加。与空白样品相比，米糠膳食纤维粉添加量为5.0%，10.0%，15.0%，20.0%时，α-螺旋含量分别减少了2.01%，2.76%，2.87%，3.15%，6.46%。可见，当米糠膳食纤维粉添加量大于15.0%时，α-螺旋含量显著（P<0.05）降低。其原因可能是超高压均质处理所产生的高剪切力虽然破坏了膳食纤维分子结构中的无定形区，但是对其结晶区结构影响较小[23]，因而当膳食纤维添加量过高时，因空间位阻效应而阻碍了面筋蛋白网状结构的形成。其次，随着膳食纤维粒度下降，比表面积增加，其吸水能力增强，进而争夺蛋白质分子结合的水分子，使面筋蛋白二级结构α-螺旋结构中的氢键发生断裂，结构松散，稳定性骤降。β-转角和无规则卷曲总含量减少量分别为3.93%，3.57%，3.72%，3.74%，3.88%，而β-折叠含量增加量分别为6.94%，6.33%，6.87%，6.89%，7.79%，亦都呈现先减少后增加的趋势，β-转角和无规则卷曲总含量的减少量与β-折叠含量增加量的变化趋势相同。三者之间发生了转变，β-转角和无规则卷曲转变成β-折叠结构，这与Agnieszka[24]和Bock 等[25]的研究结果是一致的。由此可见，添加了米糠膳食纤维粉的面筋蛋白二级结构呈现由反转向折叠转化的变化趋势。再结合α-螺旋含量的变化结果，当米糠膳食纤维粉的添加量控制在15%以下时面筋蛋白的空间结构都趋于稳定。

表3 面筋蛋白质酰胺I 带波数二级结构指认Table 3 Wave number secondary structure designation of the gluten-protein amide I band

表4 米糠膳食纤维粉不同添加量的面筋蛋白质二级结构的百分含量Table 4 Percentage of gluten protein secondary structure of different rice bran dietary fiber additions

3 结论

本文首先对米糠膳食纤维进行超高压均质处理，其后将其添加于面粉中。通过对面粉、面筋蛋白结构的研究发现，当米糠膳食纤维粉添加量控制在15.0%以内时，随着膳食纤维粉添加量的增加，一方面面筋蛋白二级结构中α-螺旋结构含量下降，维持α-螺旋结构的氢键遭到破坏，面筋蛋白结构变为松散；另一方面，β-转角和无规则卷曲转变成β-折叠，蛋白二级结构又趋于稳定。高压均质处理可作为膳食纤维物理改性的有效手段应用于米糠膳食纤维的微粒化处理。