自身免疫性肝炎患儿外周血单个核细胞miRNA-181c表达与干扰素γ、趋化因子配体10、Toll样受体4的相关性分析

崔海霞， 金春梅， 吴政燮， 金爱花， 张美兰

延边大学附属医院 检验科， 吉林 延吉 133000

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一种以肝脏炎症性改变为主要特点的自身免疫性肝脏疾病，患者主要以高丙种球蛋白血症、自身抗体阳性以及转氨酶水平升高为特征，可进展为肝硬化，甚至肝衰竭[1-2]。AIH可发病于各个年龄阶段，随着年龄的增加，发病率随之增加，高发年龄10～30岁，最小发病率年龄为6个月，女性发病率高于男性[3]。目前对于AIH的发病尚未阐明，一般认为是遗传因素与环境因素共同作用所引起[4-5]。目前关于儿童AIH的研究报道尚少，本研究旨在探究儿童AIH患者外周血单个核细胞(PBMC)miRNA-181c的表达与干扰素γ(IFNγ)、趋化因子配体10(CXCL10)、Toll样受体4(TLR4)的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年3月-2019年5月本院收治的儿童AIH患者作为AIH组。纳入标准：(1)AIH诊断标准参考国际自身免疫性肝炎小组(IAIHG)[6]评分系统；(2)年龄<18岁；(3)起病至确诊时间≥1个月；(4)未曾接受免疫抑制剂或激素治疗；(5)受试儿童家属自愿签署知情同意书。排除标准：(1)病毒性肝炎、肝硬化、其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤及其他原因所导致的肝损伤；(2)合并HIV感染。另选取同期健康体检的儿童作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司)；SYBR Green Realtime PCR试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)；SYBR Green Realtime RT试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)；PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；全自动生化分析仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.2.2 肝功能及免疫球蛋白指标检测 采用全自动生化分析检测两组受试儿童肝功能及免疫球蛋白指标，包括AST、ALT、GGT、TBil、IgA、IgG和IgM。

1.2.3 PBMC miRNA-181c、TLR4 mRNA检测 采集受试儿童清晨空腹静脉血，采用Ficoll分层液分离得到PBMC，使用Trizol法提取PBMC中总RNA， 并进行RNA纯度及完整性测定。以提取的RNA作为模板，制备cDNA。然后以cDNA为模板进行PCR检测，循环参数设定为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，共45个循环，做溶解曲线及扩增曲线验证扩增产物特异性，设定极限值和阈值，读取阈循环(Ct)值，以U6作为内参基因，采用2-△△Ct法计算miRNA-181c及TLR4 mRNA相对表达量。real-time PCR反应引物序列(表1)设计参照文献[7]，引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 real-time PCR反应引物序列

1.2.4 外周血IFNγ、CXCL10检测 采集受试儿童清晨空腹静脉血，离心后分离血清，采用酶联免疫吸附法测定IFNγ、CXCL10水平。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由延边大学附属医院伦理委员会审批(批号：2015伦审第21号)。

2 结果

2.1 一般资料 AIH组共纳入27例，其中19例患儿经肝穿刺检查确诊，男11例，女16例，年龄1～16岁，平均(7.21±2.03)岁，起病至确诊时间1～20个月，平均(8.84±3.02)个月。对照组30例，其中男10例，女20例，年龄1～15岁，平均(7.42±3.15)岁。两组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

2.2 肝功能指标比较 AIH组患儿肝功能指标AST、ALT、GGT及TBil水平均高于对照组，差异有统计学意义(P值均<0.001)(表2)。

表2 两组肝功能指标比较

2.3 免疫球蛋白指标比较 AIH组患儿IgA、IgM及IgG水平均明显高于对照组(P值均<0.05)(表3)。

表3 两组免疫球蛋白指标比较

2.4 PBMC miRNA-181c相对表达量比较 AIH组患儿PBMC miRNA-181c相对表达量低于对照组，差异有统计学意义(0.784±0.173 vs 1.106±0.224，t=5.819，P<0.05)。

2.5 IFNγ、CXCL10及TLR4 mRNA水平比较 AIH组患儿IFNγ、CXCL10及TLR4 mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P值均<0.05)(表4)。

2.6 相关性分析 相关性分析结果显示，AIH患儿PBMC miRNA-181c表达与IFNγ、CXCL10、TLR4、AST、ALT、GGT、TBil及IgG呈负相关(r值分别为-0.316、-0.348、-0.322、-0.427、-0.442、-0.408、-0.396、-0.321，P值均<0.05)，与IgA、IgM无明显相关性(P值均>0.05)(图1)。

表4 两组IFNγ、CXCL10及TLR mRNA表达水平比较

2.7 各指标对AIH发生影响的单因素分析 采用logistic单因素回归分析各指标对AIH发生的影响，结果显示，AST、ALT、GGT、TBil、IFNγ、CXCL10、TLR4 mRNA及miRNA-181c均进入回归模型(P值均<0.05)(表5)。

3 讨论

目前研究[8]认为，AIH发病与自身抗原、遗传倾向、诱发因素和免疫调节等因素相关。儿童AIH临床表现各异，可无特异性临床症状，也有部分患儿出现爆发性肝衰竭。根据临床表现，目前将儿童AIH分为急性、慢性以及隐匿性3种[9]。急性起病的患儿一般表现为厌食、乏力、腹痛、呕吐、黄疸、嗜睡等，与病毒性肝炎相关症状相似，其中部分患儿病情快速进展甚至发展为肝衰竭或肝硬化；慢性起病的患儿主要以肝性脑病、腹水等肝衰竭或肝硬化相关并发症为主要临床表现；隐匿性AIH患儿一般有疲劳、食欲下降、消瘦以及间歇性黄疸等非特异性表现；对于合并其他疾病的AIH患儿则主要以肝外症状为主要临床表现[6,10]。肝脏病理是目前诊断儿童AIH的重要方式之一，可有效反映患儿病情严重程度以及患儿临床预后[11]。与成人AIH肝脏病理变化相类似，儿童AIH的典型特征为界面性肝炎以及门静脉周围肝细胞玫瑰样改变[12]。

儿童AIH的发病机制目前尚未阐明，主要认为是遗传因素以及环境因素共同作用的结果，但免疫系统无疑在其中扮演了关键角色。近年来，miRNA在控制和调节免疫方面的作用研究报道日益增多。研究[13-14]显示，miRNA在多种自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要的调控作用，其中miRNA-181c是免疫调节的重要miRNA之一。miRNA-181c作为miRNA-181家族成员之一，位于第19号染色体上，其基因组结构在进化上非常保守。研究[15]显示，在原始T淋巴细胞和活化CD4+T淋巴细胞中筛选差异表达的miRNA时，发现miRNA-181c可调控CD4+T淋巴细胞活化潜力；进一步研究发现，体外miRNA-181c表达水平在T淋巴细胞活化过程中有所降低，转染miRNA-181c模拟物可部分抑制T淋巴细胞活化，从而证实miRNA-181c对CD4+T淋巴细胞具有着负调控作用。

表5 各指标对AIH影响的单因素logistic回归分析

本研究结果显示，AIH组患儿肝功能指标AST、ALT、GGT、TBil水平及免疫球蛋白IgA、IgM及IgG水平均明显高于对照组，与患儿目前临床检查情况相符。此外，AIH组患儿PBMC miRNA-181c相对表达量明显低于对照组，与miRNA-181c在自身免疫性肝病中具有一定的调控作用相似[16]，其在儿童AIH中也出现一定的异常表达。T淋巴细胞在AIH的免疫调节机制中发挥重要作用，其中IFNγ作为辅助性T淋巴细胞(Th)1主要的分泌因子之一，通过激活细胞毒性T淋巴细胞以及巨噬细胞发挥细胞免疫介导效应[17]。CXCL10能够趋化招募活化的T淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞迁移，从而介导Th1型炎症反应，介导免疫细胞的活化与迁移，参与多种免疫系统疾病的免疫调控过程[18]。TLR是近年来发现一类主要表达于天然免疫细胞表面的模式识别受体，其能够识别损伤以及感染信号，是组织损伤、感染以及炎症的桥梁，但是过度的TLR信号也与自身免疫疾病的发生有关[19]。IFNγ、CXCL10和TLR4可能是促进自身免疫性疾病发生发展的重要细胞因子，因此本研究分析了患儿外周血miRNA-181c与IFNγ、CXCL10及TLR4表达的相关性，从而进一步了解miRNA对儿童AIH的调控机制。研究结果显示，AIH组患儿IFNγ、CXCL10及TLR4 mRNA表达显著高于对照组，与相关研究[20]结果相似，AIH的发生与免疫细胞紊乱有关。此外，相关性分析结果显示，AIH患儿PBMC miRNA-181c表达与IFNγ、CXCL10、TLR4、AST、ALT、GGT、TBil及IgG呈负相关，进一步提示在AIH患儿中miRNA-181c对疾病的调控与免疫细胞因子IFNγ、CXCL10、TLR4的表达密切相关。miRNA-181c可能通过对机体免疫系统的调控而影响AIH的发生；同时，miRNA-181c表达与患儿肝功能变化有关，也进一步证实了miRNA-181c与AIH疾病的进展有关，miRNA-181c异常表达可能是儿童AIH发生发展的分子调控机制之一。

由于本研究纳入样本量较小，难以针对不同临床表现类型的AIH患儿及其疾病进程与miRNA-181c调控作用的关系进行深入探索，日后需要进一步扩大样本量，以获得更为可靠的临床数据和更有意义的研究结果。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：崔海霞等负责课题设计，资料分析，撰写论文；金春梅、金爱花等参与收集数据，修改论文；吴政燮、张美兰等负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。