miR-21在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中的作用分析

张富娟，陈铁军，于丽萍

(本溪市中心医院，辽宁 本溪 117000)

非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%，具有发病率高、预后差的特点[1].手术、放化疗是目前临床治疗非小细胞肺癌的主要手段，因多数患者确诊时已发展至中晚期，失去了手术机会，仅能接受放化疗治疗，但传统化疗的5 a生存率低于20%[2].近年来，随着生物靶向治疗技术的快速发展，为中晚期非小细胞肺癌患者带来新的希望[3].厄洛替尼作为表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)的代表药物，可有效提高非小细胞肺癌患者预后水平[4].临床观察发现，厄洛替尼一线治疗无进展生存期(PFS)明显优于化疗[5].但治疗1 a后多数患者会出现厄洛替尼耐药，是肺癌患者死亡的主要原因[6]，因此，探讨厄洛替尼耐药机制具有重要意义.

miR-21位于17q23染色体上，是潜在的非小细胞癌分子标志物，对肿瘤细胞具有促生长和抗凋亡作用[7].有研究[8-10]发现：在多种耐药肿瘤细胞中存在miR-21表达上调，包括miR-21过表达可诱发胃癌细胞对阿帕替尼的耐药，介导胰腺癌对吉西他滨的耐药，介导膀胱癌细胞对阿霉素的耐药.而miR-21与非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的关系有待研究证实.本研究选用了EGFR敏感型肺癌细胞株PC-9，在体外诱导出厄洛替尼获得性耐药株细胞模型PC-9/ER，并通过转染siRNA下调miR-21的表达，旨在探讨miR-21在非小细胞肺癌厄洛替尼获得性耐药中的作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肺腺癌PC-9细胞(南京科佰生物科技有限公司)；使用1～5 μmol/L的厄洛替尼诱导PC-9细胞8个月，再以0.1 μmol/L的厄洛替尼连续培养得到获得性耐药细胞株PC-9/ER.胎牛血清、DMEM细胞培养基(苏州艾莱萨生物科技有限公司)；CCK-8、Trizol试剂(上海康朗生物科技有限公司)；鼠抗人miR-21单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG(上海默悉生物科技有限公司)；miR-21单基因套装siRNA(上海吉玛制药技术有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养及CCK-8检测

1.2.2 实时定量PCR检测

应用Trizol法提取各细胞总RNA，反转录得到cDNA.miR-21、GAPDH引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成.miR-21上游5′-ATGG GTGCTCG TACTGCTG-3′，下游5′-ACTCGATCGG AAACTCTGACAG-3′；内参GAPDH上游5′-TTCC GCTCCGAGACACGAGCG-3′，下游5′-GGCGGTCGA GTGGTACCTACTAC-3′.反应条件：95 ℃ 40 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共40个循环，延伸72 ℃ 30 s.扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算miR-21的相对表达量.

1.2.3 细胞转染及对PC-9/ER耐药性的影响

取PC-9/ER细胞，使用阳离子脂质体法进行细胞转染，分为阴性对照组、siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组.转染前按6×105个/孔的密度将细胞接种于6孔板中，培养至贴壁生长后，按siRNA说明书操作.使用riboFECTCP转染试剂稀释各组储存液，加入FECTTM CP转染试剂，室温下静置20 min，加入细胞培养液中，常规培养24 h，通过实时定量PCR检测各转染组细胞miR-21表达量.选取表达量最低组的siRNA为基因敲减工具，使用终浓度10-2、10-1、100、101、102的厄洛替尼处理PC-9/ER细胞48 h后，应用CCK-8检测细胞生存分数.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度厄洛替尼处理后PC-9与PC-9/EP的生存分数

随着厄洛替尼终浓度的增加，PC-9细胞和PC-9/ER细胞的生存分数均出现不同程度的下降，其中，厄洛替尼终浓度10-2、10-1、100、101、102的PC-9/ER细胞生存分数明显高于PC-9细胞，差异具有统计学意义(P<0.01).计算得到PC-9/ER细胞的IC50值为(7.74±1.49)μmol/L，明显高于PC-9细胞的(0.11±0.03)μmol/L，差异具有统计学意义(t=21.493，P=0.001)；PC-9/ER细胞的耐药指数为69.93±18.40，说明厄洛替尼耐药细胞株PC-9/ER构建成功，能够用于后续实验.见表1.

2.2 miR-21在PC-9与PC-9/EP细胞中的表达水平

由于厄洛替尼对PC-9细胞的IC50均值为0.11 μmol/L，因此，本研究选用质量浓度为0.1 μmol/L的厄洛替尼处理PC-9、PC-9/ER细胞48 h，检测miR-21表达量，结果显示：PC-9/ER细胞的miR-21表达量明显高于PC-9细胞，差异具有统计学意义(P<0.01).为进一步分析miR-21表达与厄洛替尼剂量的关系，本研究用0.1、0.2、0.3 μmol/L的厄洛替尼处理PC-9、PC-9/ER细胞，结果显示：随着厄洛替尼浓度的增加，PC-9/ER细胞的miR-21表达量显著提高，而PC-9细胞的miR-21表达无明显变化.见表2.

2.3 不同敲减工具对PC-9/ER细胞中miR-21表达的影响

为筛选下调PC-9/ER细胞中miR-21表达的基因敲减工具，转染24 h后通过实时定量PCR检测各转染组PC-9/ER细胞miR-21的表达量，结果显示：与阴性对照组比较，siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组的miR-21表达量明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；其中siRNA-1组miR-21表达量明显低于siRNA-2组、siRNA-3组，差异具有统计学意义(P<0.05).因此，选用siRNA-1基因敲减工具用于后续实验.见表3.

2.4 下调miR-21表达对PC-9/ER细胞厄洛替尼耐药性的影响

使用终浓度10-2、10-1、100、101、102的厄洛替尼处理PC-9/ER细胞48 h后，siRNA-1组PC-9/ER细胞的细胞生存分数明显低于阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).见表4.

表1 不同浓度厄洛替尼处理后PC-9与PC-9/ER细胞的生存分数Tab.1 Survival scores of PC-9 and PC-9/ER cells treated with erlotinib at different concentrations

表2 miR-21在PC-9与PC-9/ER细胞中的表达水平Tab.2 miR-21 expression levels in PC-9 and PC-9/ER cells

表3 各组PC-9/ER细胞中miR-21表达量Tab.3 miR-21 expression in PC-9/ER cells of each group

表4 两组PC-9/ER细胞的生存分数Tab.4 PC-9/ER cell survival scores of the two groups

3 讨 论

miR-21作为一种致癌miRNA在肺癌、胰腺癌、直肠癌等多种恶性肿瘤的发生、发展中具有重要作用[11-12].相关研究[13]显示：miR-21在癌组织中表达水平明显高于癌旁组织，且高表达提高了非小细胞肺癌患者术后复发、转移的风险，不良预后发生率高.近年来研究[14-15]发现：EGFR-TKI靶向治疗肺癌耐药性的出现与miRNA异常表达有关，使用EGFR-TKI能够抑制miR-21的表达，提示miR-21可能调控EGFR信号通路.因此，推测致癌基因miR-21可能参与了EGFR-TKI药物代谢及耐药性的发生.厄洛替尼是一种低分子EGFR-TKI，为晚期或转移性非小细胞肺癌患者带来了新希望，并逐渐得到临床认可.EGFR-TKI初治患者在治疗起始多数能有效抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，缓解病情，但随着治疗时间的延长，发展为获得性耐药的比例很高，是肺癌患者死亡的主要原因之一.有研究[16]对EGFR-TKI的耐药机制进行了探讨，获得了MCT酶抑制剂、EMT抑制剂等多种活性成分，但研究多停留在动物实验和体外细胞实验层次，并未应用于临床治疗.本研究在已有研究报道的基础上，探讨非小细胞肺癌细胞对厄洛替尼的耐药机制，旨在为研发逆转厄洛替尼耐药的靶向治疗方案提供理论依据.

本研究选用了EGFR敏感型肺癌细胞株PC-9，并在体外诱导出了厄洛替尼获得性耐药株细胞模型PC-9/ER，通过实时定量PCR检测显示，PC-9/ER细胞miR-21表达水平较PC-9细胞明显提高.为进一步证实miR-21在PC-9细胞厄洛替尼获得性耐药中的作用，本研究通过siRNA转染技术下调了miR-21在PC-9/ER细胞中的表达，结果显示：miR-21表达下调明显改善了PC-9/ER细胞对厄洛替尼的耐药性.相关研究[17-18]显示：非小细胞癌细胞中过表达miR-21可明显激活Akt信号通路，促进肿瘤细胞的上皮间质转化，而出现上皮间质转化的非小细胞肺癌被认为是厄洛替尼获得性耐药的主要原因之一.亦有研究[19]显示：miR-21在卵巢癌中通过活化PI3K-Akt信号通路介导对铂类化疗药物的耐药.在下一步的研究中，将通过基因芯片技术比较PC-9细胞与PC-9/ER细胞的表达，发现信号蛋白的表达差异，进一步探讨厄洛替尼获得性耐药的分子机制.