拉萨裂腹鱼人工繁殖初探

曾本和，杨瑞斌，刘海平，王 建，徐兆利，何林强，曾小理，赵天一，林少卿

(1.西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，拉萨 850002；2.华中农业大学，武汉 430070；3.西南大学动物科学学院，重庆 402460；4.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223；5.西藏自治区畜牧总站，拉萨 850000)

拉萨裂腹鱼(Schizothoraxwaltoni)俗称拉萨弓鱼、贝氏裂腹鱼、尖嘴鱼，隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)裂腹鱼属(Schizothorax)，仅分布于西藏地区雅鲁藏布江中上游干、支流及附属水体，资源量少，生长速度缓慢，性成熟年龄较迟，为我国的特有种，也是西藏地区主要的经济鱼类之一[1]。近几十年以来，由于水电水利设施的兴建[2]、外来鱼类入侵[3]、过度捕捞[4]、水质环境恶化[2]，拉萨裂腹鱼被《中国脊椎动物红色名录》列为易危鱼类(VU)[5]。因此，研究并保护拉萨腹鱼资源迫在眉睫。

目前有关拉萨裂腹鱼的研究资料较少，仅见于其分类学[6-7]、起源和演化[6,8]。近几年，对拉萨裂腹鱼的研究开始增多，但也只是集中在分子系统发育与生物地理学[9-10]、年龄与生长[11]、食性组成[12]和人工驯养[13-15]，有关拉萨裂腹鱼人工繁殖研究几近空白。为保护和利用拉萨裂腹鱼资源，本试验研究了拉萨裂腹鱼人工繁殖方面的参数，旨在积累拉萨裂腹鱼的繁殖生物学方面的基础资料，为完善人工繁育技术、实施增殖放流奠定基础。

1 材料和方法

1.1 亲鱼来源及暂养

2019年4月，从雅鲁藏布江拉萨至日喀则江段及拉萨河收集野生亲鱼4批，总计376尾，其中雌性203尾。暂养于西藏土著鱼类增殖育种场，暂养池为长4 m×宽3 m×深0.5 m的室内水泥池，进水口流速0.4 m/s，24 h增氧，流水刺激。检查雌鱼，挑选出能直接挤卵的60组，直接人工授精，雌雄比1 ∶1。能用于催产的亲本83组，用于人工催产亲本选择标准为体形正常、体质较好，雌鱼腹部膨大、柔软，倒提腹部下塌，泄殖孔凸起的；雄鱼选择大小均匀，上颌部珠星明显，轻压腹部有乳白色精液，遇水即散的个体。

1.2 人工催产

催产药物组合为地欧酮(domperidone,DOM)和促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)，采用1针注射，每千克雌鱼注射10 mg DOM+10 μg LHRH-A2，每千克雄鱼注射5 mg DOM+5 μg LHRH-A2，催产药物溶剂为注射用葡萄糖。注射激素后，跟踪观察亲鱼反应情况，每24 h检查雌鱼1次，一旦发现能顺利挤出卵子，采用100 g/m3的MS-222进行麻醉，称量体重、体长后进行干法人工授精。

催产率=(产卵的雌鱼数/催产的雌鱼数)×100%。

效应时间为注射催产剂到发情产卵排精的时间。

1.3 精子活力观察

雄鱼在催产前，催产1、2、3、4、5 d各随机取5尾鱼，将精液(直到挤不出)置于5 mL带刻度离心管中，记录精液体积，存放于4 ℃冰箱，每隔2 h观察一次精子活力，直到绝大部分精子停止运动。雄鱼催产精子活力的观察和测定参照文献[16]方法并改进运用。可用于人工授精精子标准：整个视野中70% 精子呈“旋涡”状运动，无法看清精子的运动路线，时间不少于40 s。精子有效保存时间为在4 ℃条件下，从精液挤出直到不能用于人工授精的时间。

1.4 人工授精

采取干法进行人工授精。用于干法人工授精的精液先用离心管收集，遮光存放于冰盒中，在显微镜下镜检，使用活力好的精液。雌雄比为1 ∶1。

1.5 人工孵化

孵化容器为48 cm×35 cm×4 cm的自制孵化框，孵化框置于280 cm×50 cm×25 cm平列槽中，从一端进入曝气后的井水，水交换量为3次/h，平列槽中水流速0.01～0.02 m/s，溶氧≥8 mg/L，水温11.5～12.0 ℃。将受精卵平铺在孵化框内，孵化密度5～7 粒/cm2，每天8:00、16:00、24:00搅动鱼卵1次，防止鱼卵堆积，局部缺氧死亡。第3～4 d，鱼卵发育到原肠中期-晚期，剔除死鱼并统计鱼卵受精率。

鱼卵受精率=100%×原肠中期活卵数/鱼卵总数

鱼卵孵化率=100%×出膜鱼苗数/受精卵总数

1.6 数据处理与分析

数据通过Excel 2010进行计算、统计与作图，雄鱼精液量及有效保存时间数据采用Spss 19.0统计软件中one-way ANOVA进行单因子方差分析，若差异显著，则采用Duncan′s进行多重比较，差异显著水平为P<0.05。

2 结果

2.1 自然生产拉萨裂腹鱼雌鱼产卵量、受精率及孵化率

2019年4月1日、4月3日、4月5日、4月9日收集的4批拉萨裂腹鱼亲本自然产卵60组，共计产卵77.58万粒。亲本体重(752.06～2 932.95)g，平均(1 643±395)g；体长(45.1～60.5)cm，平均(51.64±3.08)cm；每组产卵量(3 012～30 208)粒，总产卵量77.58万粒；总计获得受精卵66.02万粒，受精率(54.29～99.53)%，平均(85.10±11.13)%；总计出膜鱼苗56.61万尾，孵化率(5.00～98.08)%。

2.2 人工催产雌性亲本效应时间、催产率、受精率及孵化率

亲本效应时间72～96 h，72 h占比90.67%，96 h占比9.33%。2019年4月3日催产拉萨裂腹鱼亲本68组，4月5日～4月6日累计繁殖63组，催产率92.65%；2019年4月7日，催产15组，4月9日累计繁殖12组，催产率80%。4月3日和4月7日繁殖两批拉萨裂腹鱼亲本总计75组，平均催产率90.36%。两批雌鱼体重范围(1 048.26～2 910.06)g，平均(1 574±375)g；体长范围(48.6～66.0)cm，平均(50.79±3.63)cm；产卵量(5 720～42 425)粒/尾；受精率(37.43～99.77)%，平均(79.07±16.14)%；孵化率(6.36～99.44)%，平均(87.86±24.80)%。

2.3 拉萨裂腹鱼雌性亲本体长体重与产卵数量关系

拉萨裂腹鱼雌性亲本体长体重与产卵数量关系见图1～2。随着拉萨裂腹鱼雌性亲本体长体重增加，拉萨裂腹鱼产卵量逐渐增加。

图1 拉萨裂腹鱼体重与产卵总数量关系

2.4 人工催产雄性亲本精液数量及质量

人工催产雄性亲本精液数量及质量见表1～2。随着人工催产时间增加，拉萨裂腹鱼雄鱼精液量呈先升高后降低变化趋势，且在第2 d精液量最多(8.58±5.28)mL，同1 d和3 d差异不显著，显著多于未催产和催产4 d、5 d雄性亲本精液量。

表1 拉萨裂腹鱼雄鱼催产时间和精液量关系

在4 ℃条件下，拉萨裂腹鱼精液有效保存时间在未催产和催产1 d差异不显著；催产第2 d，有效保存时间显著升高，且达到最大值(46.4±18.02)h；催产第3 d后，精液有效保存时间显著降低。

图2 拉萨裂腹鱼体长与产卵总数量关系

表2 拉萨裂腹鱼雄鱼催产时间和精液有效保存时间的关系

3 讨论

3.1 自然产卵和人工催产产卵量、鱼卵受精率及孵化率比较

本实验中，自然产卵亲本单位体重及体长产卵量低于人工催产亲本，受精率高于人工催产亲本，孵化率低于人工催产亲本。其原因可能是在野外自然成熟亲本，运输过程中部分卵粒流出，导致其单位体重产卵量较人工催产低。受精率和孵化率受鱼类卵子质量、精子质量及操作方法的影响，在精子质量和操作方法相同时，卵子质量决定鱼卵受精率和孵化率。在自然界，野生亲本性腺能正常发育成熟；人为捕捞后，受环境的影响，亲本性腺很难继续发育，性腺发育接近V期的亲本可以通过注射性激素刺激，达到性成熟；因此，理论上自然成熟亲本鱼卵质量较人工催产亲本好。但张良松对野生异齿裂腹鱼[17]的研究发现，自然成熟亲本由于部分性腺已发生退化过熟，其受精率、孵化率低于人工催产的亲本。由于自然界亲本成熟时间不明确，且不同亲本成熟时间不同步，能获得自然成熟亲本数量较少，因此，在拉萨裂腹鱼规模化人工繁殖过程中一般选择性腺接近成熟的亲本进行人工催产。

3.2 拉萨裂腹鱼催产效应时间影响因素

鱼类人工催产效应时间受鱼的种类、催产药物种类、剂量及环境水温等因素的影响。适宜种类的催产药物及剂量可获得较好的催产率并适当缩短催产效应时间。本试验中拉萨裂腹鱼催产药物种类及剂量较细鳞裂腹鱼[18]、重口裂腹鱼[19]、齐口裂腹鱼[20]、异齿裂腹鱼[17]、拉萨裸裂尻鱼[21]均差别较大，催产效应时间也长于以上鱼类(表3)，这可能是与鱼种类、催产药物种类及计量、养殖水温有关。水温是影响鱼类催产效应时间的主要因素，一般水温越高，效应时间越短。鱼类适宜催产水温根据鱼类生存水域环境水温不同而不同，细鳞裂腹鱼在水温低于13 ℃时无法产卵，高于18 ℃时性腺则会出现严重退化[18]。试验中拉萨裂腹鱼长期生活在高原水域环境中，水温较低，因此拉萨裂腹鱼催产水温较低，催产效应时间较长。关于缩短拉萨裂腹鱼人工催产效应时间有待进一步研究。

表3 拉萨裂腹鱼与其他裂腹鱼鱼类催产剂量、效应时间与水温比较