国产DNA测序仪及提取试剂在接触DNA检验中的应用

李涛 张丹丹 焦灵霞 河南省周口市商水县公安局

引言

随着科技的发展、网络的普及、法制化的推进，高智商犯罪越来越多，嫌疑人能够获取更多的反侦察技术，嫌疑人在现场遗留的指纹、有价值的足印、血迹在现场已经很难提取到，加上嫌疑人的刻意伪装回避、不携带通讯工具等手段，现场视频、技术侦查手段也无从使用，此时犯罪现场接触DNA的提取和检验就显得尤为重要。接触DNA检材属于微量疑难生物检材，其检验是法医DNA检验的难点和热点[1]，随着微量检材数量日益增多，如何提高接触DNA的检验成功率，成为每个DNA实验室都要面临的关键问题。

一、接触DNA检验方案

以往文献对于接触DNA检验成功率的报道结果差异较大，从9%到45%不等[2]。由于接触DNA检测步骤复杂，检验成功率易受各环节多因素影响，导致检验成功率差异很大，接触DNA检材从检测流程上来讲与其它常见生物检材并无差异，同样可分为提取、扩增、电泳及结果分析等步骤，但接触DNA检验在上述环节的具体操作上有其特殊性，包括关键接触部位的确定与发现、接触DNA的提取与纯化、扩增参数的选择、电泳参数的设定、结果的分析与运用等，对实验人员的技术水平提出了较高要求。

对于接触DNA检验，在前处理环节上，应结合具体案情分析和载体的物理特性，有针对性的选择两步擦拭、直接剪取、胶带粘取、真空吸附、震荡冲洗等合适的方法进行前处理；在提取环节上，可选用常见的磁珠法、硅珠法、Chelex-100等，目前有很多商业化的试剂盒及提取工作站可供选择，常见的提取试剂盒如DNA IQTM试剂盒、QIAampTMDNA Investigator试剂盒、D盾超敏提取试剂盒、超高效硅珠纯化DNA提取试剂盒等，同时许多核酸自动提取仪如KingFisherTM、 QIACubeTM、 MagNA PureTM等都提供配套的纯化试剂盒可供选择[2]，为得到更高纯度的接触DNA，还可以通过调整洗脱液体积或采用离心超滤管与配套试剂盒进行浓缩[3]；PCR扩增环节可以采用增加循环数、缩小反应体系、优化引物、延长退火时间、改变缓冲体系等不同的方法来提高检验灵敏度；电泳检测可通过增加上样量（提高上样电压或增加进样时间）、增大激光器功率、使用高质量甲酰胺等方法改善电泳质量；数据分析环节可采取降低分析阈值、进行重复检验认定多次出现的等位基因等方法谨慎研判和应用DNA分型结果。

商水县公安局DNA实验室自2017年底投入使用以来，采用D盾超敏DNA提取试剂盒[4]、 PowerPlexTM21和VeriFilerTMPlus扩增试剂盒、国产GA118-16A型遗传分析仪进行接触DNA检验，取得了较好的检验效果，在打击犯罪、维护社会稳定方面效果明显。

二、典型应用案例

（一）案例资料

2019年9月27日，商水县某村村民苏某家的狗在门口被人盗走，因涉案价值不够立刑事案件，派出所民警未通知技术人员出现场，从苏某家大门口地面上提取毒镖（1号检材）一枚。

2020年4月26日，村民郭某某家院内养的杜宾犬被盗，价值10000多元，技术人员现场提取嫌疑人翻墙木梯子上粘取物（2号检材）1份、绑有鸡头的药狗蛋（3号检材，图1）1个、毒镖（4号检材，图1）1枚。

（二）接触DNA检验

1.检材前处理及DNA提取

（1）毒镖（1号检材）：对毒镖针管管身用脱落细胞粘取器分段粘取后，用棉签分干湿两步擦拭提取，之后将粘取器上粘性胶片、棉签擦拭物放入1.5ml离心套管中，加入200 μL裂解液，漩涡振荡10s后56℃孵育30min，再99℃裂解10min。裂解结束后17000g离心3min，弃除离心套管，加入1000 μL吸附液和20 μL吸附珠，室温静置15min后8000g离心30s去除上清液，再向沉淀物中加入-20℃漂洗液800 μL，将沉淀物充分震开后8000g离心30s，去净上清液，烘干，加入35 μL洗脱液，56℃孵育20min；

（2）木梯粘取物（2号检材）：将脱落细胞粘取器上粘性胶片剥离后导入离心套管，按D盾超敏DNA提取试剂盒说明书进行提取；

（3）绑有鸡头的药狗蛋（3号检材）：分离药狗蛋和鸡头，将绑线剪成小段后直接放入离心套管，再对胶囊部分用棉签分干湿两步擦拭提取，提取尽量避开油污，按D盾超敏DNA提取试剂盒说明书进行提取；

（4）毒镖（4号检材）：对毒镖针管管身分段粘取后用棉签分干湿两步擦拭提取，之后粘取器上粘性胶片、棉签擦拭物分开放入1.5ml离心套管中；针管与尾翼结合处的缠绕胶带，先用棉签擦拭后用镊子剥离管身，分段剪开，将碎片和棉签分开放入1.5ml离心套管，其余处理步骤同1号检材。

2.PCR扩增

1号检材用PowerPlexTM21试剂盒进行扩增，扩增总体积10 μL，DNA模板6 μL；2、3、4号检材用VeriFilerTMPlus试剂盒扩增（与1号检材检验时间不同），扩增总体积10μ L，DNA模板7 μL，其余操作按试剂盒说明书要求进行。

3.电泳检测

上述扩增产物在GA118-16A型测序仪上按标准程序进行电泳检测，应用GeneMapperTMID-X 1.4分析软件进行分析（分析阈值50RFU）。

4.结果

经过检验，1号检材上检出1名男性DNA分型，如图2所示，经数据库查询比中前科人员申某某，嫌疑人抓获归案后经采血检验，证实申某某为该盗窃案件嫌疑人；2、3、4号检材上分别检出同一男性DNA分型，如图3所示，经数据库查询，比中前科人员顾某某，到案后经采血检验，证实顾某某确为该盗窃案件嫌疑人。

三、讨论

接触DNA检验作为一门新兴技术，应用前景广阔，在未来的案件侦破中会发挥越来越重要的作用。许多接触性检材无法检出有效分型，其原因可能有多方面，商水县公安局DNA实验室在三年多的检验工作中主要遇到以下三方面问题：检出多人混合造成的分型无法判读、抑制物较多造成的无法检出、DNA含量过低造成的无法检出。

针对上述三个问题，笔者总结出如下应对办法：

1.为了避免检出多人混合分型、应尽量缩小提取面积，分块多次提取。如上述4号检材毒镖曾经被制作人、案件受害人等多人触碰，针管管身多处检出混合分型，通过分块多次提取，在缠绕针管的胶带碎片中检出单一男性分型。

2.对可能造成扩增抑制的检材处理时，应尽量选择检材较为洁净处提取，避免提取到对扩增有抑制作用的含有酸、碱、油漆、动植物油等成分，如无法避免，应尽量少粘；提取后可对DNA先进行纯化，或者扩增时做稀释处理。如上述绑有鸡头的药狗蛋，在带油脂的药狗蛋表面擦拭物上，未检出有效分型，在绑鸡头的线绳较洁净处进行提取，检出1名男性的完整分型。

3.针对DNA含量过低造成的无法检出问题，有以下几个方面可以进行优化：

（1）为了提高检出率，在现场勘查时应充分了解案情，根据痕迹物证指向，重点提取，提取检材时应尽量多提几处，针对不同检材的洁净程度，选择不同力度提取；

（2）在进行DNA提取时，选用DNA提取率较高的方法，最大限度获得DNA模板含量；

（3）在选用提取试剂时，尽量选用灵敏度较高的试剂。本文案例中所用D盾超敏DNA提取试剂盒，虽是国产试剂，通过商水县公安局DNA实验室三年多来的应用，其效果与进口提取试剂处于同一水平，本文案例中检材提取模板量为35μ L，是一般微量DNA检材提取模板量的近2倍，足以进行3次平行扩增或者3次梯度扩增用和2次YSTR扩增，保证检验结果的准确性。

（4）在进行电泳分型检测时，选用灵敏度高的仪器。本文案例中的检材均为接触DNA检材，使用国产提取试剂进行提取和常规扩增之后，采用国产GA118-16A遗传分析仪进行检测。结果表明，对于木梯、毒镖、药狗蛋上的脱落细胞等微量检材都获得了良好的分型，提取效果和检验质量均经得起复核[5]。

上述方法经过商水县公安局DNA实验室应用取得了良好的使用效果，三年多以来协助侦查人员打掉系列入室盗窃、盗窃车内财物、接触性诈骗、抢劫等案件犯罪团伙40余个。