硅珠法提取DNA的灵敏度及抗抑制能力探究*

赵凯 林大钧 卢俊 于瑞国 黄梓辉

1.广东省公安厅刑事技术中心2.广东省湛江市公安局

3.中国科学院广州生物医药与健康研究院4.高盛生物技术股份有限公司

引言

得益于容易实现自动化提取的优势，磁珠法作为目前主流的核酸DNA提取手段，在法医鉴定领域得到了非常广泛的应用。但在此趋势下，不易实现自动化的硅珠法仍然没有被市场淘汰，就是因为硅珠法具有磁珠法所不具备的优势。与磁珠相比，硅珠法提取在灵敏度方面并没有明显差异，而且硅珠法提取所得的产物更为纯净，适用于法医上的疑难检材提取，如陈旧骨骼、腐败组织等[1,2]。由于法医检材的复杂性以及特殊性，在提取过程中会存在各种抑制物，如泥土、灰尘、油污等，大大增加了提取的难度。因此，核酸提取方法的抗抑制能力在法医领域尤其重要。为验证硅珠法提取DNA的灵敏度，并且探究该方法的抗抑制能力，本文设计方案，模拟法医样品进行测试，以期正确评价硅珠提取法的灵敏度及抗抑制性能。

一、材料与方法

（一）材料

实验所用标准DNA为ABI公司VeriFilerTMPlus PCR扩增试剂盒中自带的007标准DNA，浓度为100pg/ul；血液样本用EDTA抗凝管采集混匀后分装，-20℃冻存，使用前随机取3管分装的血液混合，充分混匀后用无菌超纯水稀释1000倍待用；硅珠提取以及磁珠提取分别采用一款常见市售试剂盒；提取产物的扩增使用VeriFilerTMPlus PCR试剂盒，并采用ABI公司Veriti 96 Well Fast Thermal Cycler型号扩增仪；电泳分析采用ABI公司3500型号测序仪。

（二）样品处理

标准DNA混匀后直接吸取相应体积，添加至离心管上层套管待用；稀释血液混匀后吸取相应体积，滴加至棉签头上，剪下棉签头，放置到离心管上层套管待用；抗抑制能力测试组，稀释血如上所述处理好后，再添加抑制物至上层套管内，尽量混匀，待用。磁珠提取和硅珠提取的样本处理方式保持一致，每个样品设置3个重复。

（三）样品提取

样品准备好之后，硅珠提取和磁珠提取各自按说明书进行裂解、结合、清洗、烘干以及洗脱等步骤。磁珠提取最终转移上清产物待用，硅珠提取则保留硅珠得到最终产物。

（四）STR扩增及电泳分析

扩增体系为2ul Mix+1ul Primer+7ul提取产物，总共进行29个循环。硅珠提取产物可带珠扩增，因此吸取扩增模板前应充分混匀。扩增结束后使用ABI 3500测序仪进行电泳分析，体系为9.7ul HIDI+0.3ul Size Standard（LIZ 600）+1ul PCR product；电泳参数为电压1.2kV，进样时间18秒，进样量1ul。

二、结果

（一）提取灵敏度对比

对于硅珠法提取灵敏度的验证，实验设置了样品的浓度梯度进行测试：标准DNA 300pg、400pg、500pg；1000×稀释血10ul、20ul、30ul；磁珠提取仅设置标准DNA 300pg、1000×稀释血10ul进行测试。洗脱体积皆为50ul。结果如图1A所示，当DNA投入量为300pg时，硅珠提取法平均可获得23.7个位点，检出率在95%以上，与磁珠提取效率相同（图1B）；而当DNA投入量为500pg时，已经可以稳定检出全位点（25个）。对于10ul稀释血样品（图1 A），硅珠提取平均可检出21.7个位点，与磁珠提取结果相同（图1B），无显著差异（表1）；当稀释血量为30ul时，硅珠提取可稳定检出全位点。通过STR图谱分析，可知硅珠法在提取300pg DNA时，峰值范围为300~1400 RFU（图2A），相比磁珠法提取峰值范围300~4000 RFU（图2 B），在最高峰值上有所差异；在提取10ul稀释血时，硅珠法峰值范围为300~3500 RFU（图2C），效果比磁珠法（峰值范围200~1200 RFU）更优（图2D）。

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（二）硅珠提取灵敏度优化方法

纳米硅珠颗粒粒径一般比磁珠颗粒小，且不带磁核，对PCR扩增无抑制作用，因此可以带珠扩增[6]。硅珠这一特性使小体积洗脱以提高灵敏度成为可能，这也是磁珠所不具备的优势。在本实验中，设置了标准DNA 100pg、1000×稀释血5ul进行测试，洗脱体积分为10ul和20ul两个梯度。结果显示，用10ul体积洗脱时，100pg标准DNA平均可稳定检出24个位点，5ul 1000×稀释血平均可检出23.7个位点，两者位点检出率皆在94.8%以上；20ul洗脱时，100pg标准DNA和5ul 1000×稀释血皆平均可检出21.3个位点（图3A）。STR图谱显示，在10ul洗脱条件下，硅珠法提取100pg DNA的STR峰值范围可达200~1800 RFU（图3 B）；提取10ul稀释血时峰值甚至可达400~2000 RFU（图3C）。因此，通过减小洗脱体积并带珠扩增的方式，硅珠法提取DNA的灵敏度可得到显著提升（表2）。

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（三）模拟抗抑制能力测试

在真实案件中，检材类别丰富多样，经常会含有各种可能会对检材DNA的提取和扩增带来干扰的物质，因此提取方法的抗抑制能力尤其重要。本实验根据日常案件常见检材可能携带的抑制物，收集了包括铁锈、灰尘、墙灰、牙膏、果汁、油脂、单宁酸在内的7种模拟抑制物，以500pg标准DNA以及30ul 1000×稀释血为提取样本，分别加入单倍量及双倍量的抑制物进行测试，洗脱体积皆为50ul。模拟抑制物具体添加量见表3：牙膏事先均匀涂在滤纸上晾干，然后剪取适当大小纸片；果汁为人工榨取苹果、橙汁混合，常温放置1天；单宁酸事先配制成11mg/ml母液；油脂为植物油；其余材料采集自室内或室外。结果显示，在单倍量抑制物存在时，单宁酸对标准DNA及血样的结果都有较大影响，但是位点平均都在18个以上；其余抑制物则位点平均都在20个以上，对硅珠法提取的影响较小。在加倍量抑制物存在时，抑制效果比单倍量有所加强，但平均仍可获得18个STR位点以上。由此可见，硅珠法提取DNA具有良好的抗抑制能力（表4）。

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三、讨论

当检材中所含有的人源细胞被充分裂解后，纳米硅珠颗粒通过自身携带的硅羟基，在低pH、高盐条件下与DNA互相结合，在高pH、低盐条件下逆转，释放DNA[3,4]。这种提取原理简单高效，可从各类复杂样本中稳定获得高纯度的DNA，方便后续STR位点分析。通过本文的验证和测试，证实了硅珠法具有媲美磁珠法的灵敏度。在50ul洗脱时，硅珠法可稳定检出300pg标准DNA及20ul 1000×稀释血。当洗脱体积减少至10~20ul时，甚至可有效检出100pg标准DNA以及5ul 1000×稀释血。在保证灵敏度的同时，硅珠法提取还具有良好的抗抑制能力。根据本实验室以往测试及案件分析结果，本文所选取的7种模拟抑制物在日常真实案件中较为常见，且对磁珠法的提取效果皆有一定影响，而对于硅珠法提取的提取效果则影响较小。其中，单宁酸对硅珠法的影响相对较大，推测原因为单宁酸可与溶液中可溶性蛋白结合形成不溶性固体，高速离心时随着硅珠一起沉淀，最终被带到提取产物中，影响PCR扩增。另外，单宁酸可能存在于土壤或者皮革衣物中，一般含量较少，本文测试中所加的单宁酸量相对较大，因此增加了对结果的影响。

分析灵敏度测试结果发现，硅珠法提取标准DNA的效率高于提取稀释血液的效率。血液成分复杂程度远超纯净的标准DNA样品，在提取稳定性上会受到一定程度的影响。另外，为模拟真实条件，血液样本滴加在棉签头上进行裂解。在此过程中，棉纤维会牢固吸附部分DNA，使其被截留，且细微的棉纤维还会随离心进入下层管，造成硅珠及磁珠的轻微聚团，降低了吸附以及洗脱效率，最终影响STR位点检出率，这也是该类提取方法今后需要优化的方向之一。尽管如此，硅珠法在提取稀释血方面仍具有优异的表现。

经过不断的改良，硅珠法的提取效果已经得到显著提升，在真实疑难案件中的应用也常有报道[5-7]。汗潜指纹中脱落细胞稀少，较难获得完整STR分型，在雒彩虹等的研究中，硅珠法提取汗潜指纹等接触性检材效果优异[8,9]。而对于高度腐败、污秽的案件检材，硅珠法的表现也可圈可点，林大钧等就通过该方法，成功从高度腐败的肋软骨组织、污水浸泡的钢丝，以及污秽指甲垢中获取了有效的STR分型结果[10-12]。这些研究都表明，硅珠法在面对超微量、高度污秽、腐败等复杂检材时，具有更高的抗抑制能力，并且得益于可带珠扩增的特点，可以通过减小洗脱体积的方式，极大提高提取灵敏度。因此，硅珠法可作为磁珠法的重要补充，可更有效处理磁珠法提取无法检出的检材。综上所述，硅珠法作为一种具备独特优势的提取方法，必将在未来得到更广阔的应用。