不同途径感染后5 型腺病毒在C57BL/6J 小鼠体内的分布

陈伟盛，高亚奇，梁 宁，陈海宇，陈兴致，詹纯列，张修彦(中国人民解放军南部战区总医院，广州 510010)

腺病毒(adenovirus，Ad)作为基因表达载体的研究始于1960年代[1]，主要研究Ad 载体引入外源基因的可行性和安全性[2-5]。Ad 载体转导基因有很多优点[6]：①宿主范围广，既可以感染分裂期细胞，也可以感染非分裂期细胞[7-8]；②安全性好，Ad 无需整合进宿主细胞基因组，整合突变致癌率低，基因毒性小；③相对稳定，病毒基因组重排频率低；④容量大，理论上最大容量可达35 kb；⑤相对容易制备，滴度高。Ad载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。本文旨在研究滴鼻、灌胃、尾静脉注射及腹腔注射5 型腺病毒(Ad5)后，病毒在C57BL/6J 小鼠体内的分布情况，从而为Ad 载体作为基因治疗的小鼠研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6J 小鼠112 只，雌雄各半，6～8 周龄，体质量16～20 g，购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0002]，饲养于南部战区总医院动物实验中心[SYXK(粤)2019-0100]，实验程序符合南部战区总医院实验动物伦理委员会要求(20180051812)，并遵守国际惯例。

1.2 主要试剂和仪器

TRIzol(9109)购自日本Ta KaR a 公司；BestarTMqPCR RT kit(2220)、BestarTMqPCR MasterMix(2043)均购自德国DBI 公司；DEPC(6079)购自上海Macklin 公司；Ad 购自深圳市百恩维生物科技有限公司；反转录试剂盒购自德国DBI 公司；Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2×Phanta Master Mix 均购自诺唯赞生物科技有限公司；DNAzol Reagent 购自美国Invitrogen 公司；Stratagene Real time PCR(Mx3000P)仪购自美国Agilent 公司；PCR 扩增仪器(K960)购自杭州晶格科学仪器有限公司；超微量紫外分析仪(Q6000UV)购自美国Quawell Technology 公司；高速离心机(TGL-16G)和低速离心机(TDL-80-2B)均购自上海安亭科学仪器厂。

1.3 标准曲线

使用DNAzol Reagent 提取病毒DNA，取1×109pfu/mL 的Ad5 溶液125 μL，加入含有250 μL DNAzol 的离心管中，上下颠倒混匀，室温放置5 min，加入100 μL 异丙醇，置于旋涡混合器上充分混匀，室温放置5 min。6000r/min 离心5 min，弃上清，加入500 μL 75%乙醇溶液后，再6000 r/min 离心5 min，弃上清，加入8 mmol/L NaOH 溶液20 μL 溶解。提取的病毒DNA 的吸光度(A)比值A260/A280为1.86，质量浓度为1.33 μg/μL。将DNA 原液5 μL 加45 μL 双蒸水稀释10 倍，以此类推稀释102、103、104、105、106和107倍，最后用稀释液作为模板进行qPCR 检测，绘制标准曲线。

1.4 动物处理及定量聚合酶链反应(qPCR)检测

112 只小鼠分为滴鼻组、灌胃组、尾静脉注射组和腹腔注射组，每组28 只，雌雄各半。每只小鼠Ad 用量100 μL(1×109pfu/mL)。于4 种途径感染后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和7 d分别取4 组中雌雄各2 只小鼠，脱颈椎处死，解剖取淋巴结、睾丸、附睾、子宫、卵巢、脾脏、肾脏、肝脏、肺、心脏、脑、血液和骨髓组织，提取RNA。以2 μg RNA 为模板，按照Bestar qPCR RT Kit 说明书配制反转录反应体系，总体系为10 μL，反转录成cDNA。以cDNA 为模板，配制qPCR 体系。Ad5 上游引物为5'- AGGTGCTTGCCACCTATCAC-3'，下游引物为5'-TTTTGGCACTTCGTTGAGCG-3'。内参β-actin 上游引物为5'- CATTGCTGACAGGATGCAGA-3’，下游引物为5'-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3'。

在PCR 反应管中充分混匀，置入Agilent Stratagene 荧光定量PCR 仪Mx3000P 进行荧光定量PCR 实验。反应条件为：95 ℃ 2 min，94 ℃20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 循环。每个样本检测重复3次。

2 结果

2.1 标准曲线

构建标准品的扩增曲线和标准曲线如图1A和图1B。从图1A中可以看出10 倍梯度稀释后的标准品质粒有良好的特异性扩增。图1B所得到的标准曲线方程为y=-3.3877x+ 27.204，相关系数R2为0.9999，标准品起始反应模板浓度与Ct 值呈良好的线性关系。

图1 标准品的扩增曲线(A)和标准曲线(B)Figure 1 Amplication curve (A) and standard curve (B) of standard samples

2.2 Ad5 在各组织中的分布

滴鼻组在肺和脊髓中检测出Ad5，肺组织中Ad5 含量随着时间降低，处理后7 d肺组织中Ad5含量比处理后1 d 下降91.9%，4 d 比3 d 下降29.6%；脊髓组织在处理后1～3 d，Ad5 含量随时间增加，之后开始下降，7 d 比1 d 下降26.1%。

尾静脉注射组在肝脏和脾中检测出Ad5，肝脏和脾脏中Ad5 含量随时间逐渐下降。7 d 肝脏Ad5 含量比1 d 下降23.4%；脾脏含量7 d 比1 d下降93.9%，其中5 d 比4 d 下降43.8%，下降最快。

腹腔注射组在脊髓、脾脏、附睾和睾丸中检测出Ad5，脊髓Ad5 含量在感染后2 d 最高，7 d 比1 d 含量下降39.3%；脾脏和附睾中Ad5 的含量随时间逐渐下降，脾脏Ad5 含量7 d 比1 d下降94.2%，附睾含量7 d 比1 d 下降54.3%；睾丸中Ad5 含量有波动，可能是因为Ad5 含量太少，实验误差造成，其总体呈下降趋势，7 d 比1 d 含量下降64.7%。

灌胃组小鼠各器官和组织中均未检出Ad5。

图2 检测到Ad5 的小鼠组织Figure 2 Tissues of different groups with detectable adenovirus type 5

3 讨论

Ad 广泛应用于肿瘤、心血管等领域的基因传递、再生医学以及疫苗载体[9-13]。在许多临床试验中，Ad 都被证明是安全的载体[14]。研究不同途径感染后Ad5 在体内主要脏器的生物分布，可为基因治疗、疫苗载体的小鼠实验研究中给药途径选择提供可靠的实验数据。

本实验结果显示，滴鼻组小鼠在肺组织和脊髓中，可以检测到Ad。本课题组曾将Cre Ad 滴入B6.129S4-Krastm4Tyj/J 转基因小鼠鼻内，诱导其表达突变Kras基因，从而获得肺癌模型[15]。根据本实验结果，滴鼻感染后4 d Ad 下降比较多，可将每7 d 滴鼻一次优化为每3 d 滴鼻一次。

本实验结果还显示，灌胃组在所有组织中均没有检测到Ad5，这可能与消化系统对Ad5 的灭活有关。

本研究中，尾静脉注射组在肝脏和脾脏中检测到Ad5。王鸣等[16]通过尾静脉注射Ad 后7d 在肝脏基本检测不到Ad，而Ohashi 等[17]给β-葡萄糖醛酸酶缺陷小鼠静脉注射表达人β-葡萄糖醛酸酶的重组Ad，肝脏、脾脏中酶的表达至少持续到35 d。本研究结果表明，肝脏中Ad 下降速度较慢，可每7 d 重复注射一次。苗玉发等[18]给C57BL/6小鼠肌肉注射治疗性HIV 的Ad 载体疫苗，发现病毒载体在脾脏、骨髓有较少分布，性腺中没有检测到病毒载体。

本实验结果显示，腹腔注射Ad5 后，附睾和睾丸中有病毒载体，子宫和卵巢中未发现Ad5，附睾和睾丸中Ad5 含量只有其他阳性组织中检测出含量的1%～10%，脊髓中Ad5的含量比滴鼻组约高10 倍。

综上，肺部感染实验，可每3d 滴鼻一次；肝脏感染实验，可以用尾静脉注射Ad5 的方法；脾脏感染实验，可以采用尾静脉注射或腹腔注射Ad5 的方法；脊髓感染实验，可以采用腹腔注射Ad5 的方法。