枸杞面酱发酵工艺的研究

许丹妮，许良玲，陆翠，廖承谱

（1.广西民族师范学院化学与化工学院，广西崇左532200；2.广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室培育基地，广西崇左 532200；3.崇左市食品药品检验所，广西崇左532200）

枸杞是茄科、枸杞属植物，是我国一种珍贵的药食同源植物[1-2]。枸杞富含人体所需的18种氨基酸和32种微量元素，且其中独特的枸杞多糖、甜菜碱等生物活性物质具有抗氧化、降血糖、促进造血功能、抗脂肪肝、抗肿瘤、延缓衰老等作用[3-5]。枸杞含有丰富的色素类物质，其主要成分为脂溶性类胡萝卜素类化合物，如游离类胡萝卜素、类胡萝卜素脂肪酸酯[6-8]。以枸杞为原料的食品，营养价值高，具有广阔的应用前景。

面酱又称甜酱或甜面酱，是一种别具风味的传统特色发酵制品，可直接食用，也可作为调味品使用，深受人们喜爱[9]。目前，传统面酱产品种类单一，特色产品的开发较少[10-12]。在面酱发酵过程中，诸多因素会对面酱中氨基酸态氮含量造成影响，比如原料的配比、发酵剂接种量、发酵温度和发酵时间等均会影响面酱中氨基酸态氮含量，从而影响产品的品质[13]。

本研究以枸杞与面粉为原料共同发酵，在单因素试验的基础上，以面酱中氨基酸态氮的含量为响应值进行响应面试验，得到枸杞面酱制备的最优工艺，为制备特色面酱提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞：福建省安溪县昱霖茶叶有限公司，试验前干燥、粉碎，过80目筛备用；面粉：五得利面粉集团有限公司；米曲霉（沪酿3.042）：济宁玉园生物科技有限公司。

甲醛、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BKQ-B100II型高压蒸汽灭菌锅：济南博鑫生物技术有限公司；FW200型多功能粉碎机：常州金坛友联仪器研究所；FD-1B-50型真空冷冻干燥机：北京博医康仪器有限公司；MJX-280HM型霉菌培养箱：宁波莱福科技有限公司；YP20002电子天平：上海光正医疗仪器有限公司；PHS-2F型pH计：上海精科电子有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

面酱的制备参考文献[14-17]并作修改。

1）面料拌和：将500 g面粉和160 g水充分拌和，试验组用枸杞替代部分面粉，使其成为蚕豆大小的面团。

2）蒸料：将和好的面料置于高压灭菌锅121℃蒸煮10 min，蒸好后摊开冷却至35℃。

3）接种：将米曲霉菌粉接种在面料表面，混合均匀。

4）制曲：控制曲料温度在32℃～35℃，相对湿度＞80%，制曲 10 h～13 h第一次翻曲；制曲 18 h～20 h后进行第二次翻曲，使曲料温度维持在30℃～32℃，保持该温度至制曲结束。

5）发酵：向制曲完成的曲料中，按曲料与食盐水1∶1的质量比加入溶度为14°Bé的食盐水，于50℃条件下发酵20 d。

6）磨酱：将发酵好的枸杞面酱，用胶体磨磨细，过磨5次。

7）灭菌：将磨细的枸杞面酱在80℃下杀菌10 min，冷却后即为成品。

1.3.3 理化指标检测

采用国标GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的甲醛值法测定氨基酸态氮含量[18]。

1.3.4 单因素试验

1）分别以枸杞添加量为0%、3%、6%、9%、12%，发酵剂接种量为0.3%，发酵温度为50℃，发酵20 d，考察枸杞添加量对产品氨基酸态氮含量的影响。

2）分别以发酵剂接种量为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，枸杞添加量为9%，发酵温度为50℃，发酵20 d，考察发酵剂接种量对产品氨基酸态氮含量的影响。

3）分别以发酵温度为 35、40、45、50、55 ℃，枸杞添加量为9%，发酵剂接种量为0.3%，发酵20 d，考察发酵温度对产品氨基酸态氮含量的影响。

4）分别以发酵时间为 5、10、15、20、25 d，枸杞添加量为9%，发酵剂接种量为0.3%，发酵温度50℃，考察发酵时间对产品氨基酸态氮含量的影响。

1.3.5 工艺优化

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken设计原理[19]，选取枸杞添加量（A）、发酵剂接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个因素为自变量，以枸杞面酱的氨基酸态氮含量（Y）为响应值，采用响应面分析法对枸杞面酱的制备工艺进行优化，并对响应面法得到的最佳工艺进行验证。

1.4 数据处理

采用Design Expert 8.0.5b软件对响应面试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 枸杞添加量的影响

枸杞中除了含有多糖、脂肪及微量元素外，还含有丰富的蛋白质和氨基酸。面酱制曲中加入枸杞不仅可以改善面酱的品质，还可以增加面酱的种类及营养价值。枸杞添加量对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响见图1。

图1 枸杞添加量对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effects of additive amount of wolfberry on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

如图1所示，在枸杞添加量为9%时，面酱中氨基酸态氮的含量最高，可达0.76 g/100 g，与不添加枸杞组相比增加了1.3倍。但当枸杞添加量12%时，面酱中氨基酸态氮的含量只比不添加枸杞组提高了39%。由此可知，枸杞添加量过大会抑制微生物的生长代谢，影响蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等各种酶的分泌，造成面酱的氨基酸态氮含量降低。故选定枸杞添加量为6%、9%和12%进行响应面优化试验。

2.1.2 发酵剂接种量的影响

发酵剂接种量对微生物产酶的影响较大，从而影响成品中氨基酸态氮的含量，其对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响见图2。

图2 发酵剂接种量对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effects of inoculated amount of starter on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

根据图2可知，在其他条件相同的情况下，随着发酵剂接种量的不断增大，面酱中氨基酸态氮含量逐渐增加，当发酵剂接种量为0.3%时，枸杞面酱中氨基酸态氮含量达到最高为0.76 g/100 g，而当发酵剂接种量＞0.3%时，原料的碳氮比限制了米曲霉的生长代谢，其产酶活性受到抑制，从而影响成品中氨基酸态氮含量。故选取发酵剂接种量为0.2%、0.3%和0.4%进行响应面优化试验。

2.1.3 发酵温度的影响

温度对面酱的发酵过程中各种酶的活性和次级代谢产物的形成都具有显著的影响，其对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响见图3。

图3 发酵温度对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

由图3可知，枸杞面酱的氨基酸态氮含量在发酵温度35℃～55℃区间呈先增后降的趋势。当发酵温度为50℃时，氨基酸态氮含量达到最大。高温会影响代谢途径中各种酶的活力及速率，同时发酵温度过高会产生不良滋味，影响面酱的口感及品质。故选定发酵温度为45、50、55℃进行响应面优化试验。

2.1.4 发酵时间的影响

发酵时间有助于次级代谢产物的积累，其对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响见图4。

图4 发酵时间对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effects of fermentation time on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

如图4所示，枸杞面酱中氨基酸态氮含量与发酵时间呈正相关，在发酵前20 d，氨基酸态氮含量增加较快，之后发酵速度趋于平缓。故选取发酵时间为15、20、25 d进行响应面优化试验。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验方案及结果

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以枸杞面酱氨基酸态氮含量为响应值，设计四因素三水平响应面分析试验，其因素与水平见表1，结果见表 2。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels response surface experiments

表2 响应面分析试验设计方案及结果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

通过Design Expert 8.0.5 b软件中的Box-Benhnken Design模型对表2中数据进行二次响应面回归拟合，得到枸杞面酱中氨基酸态氮含量与4个因素之间的回归方程：Y=-0.12-0.064A+0.025B+0.047C+8.7×10-3D-0.017AB+7.01×10-3AC-3.09×10-3AD-0.012BC+4.16×10-3BD+8.67×10-4CD-0.15A2-0.1B2-0.064C2-0.019D2。

对模型进行方差分析及回归系数显著性检验，结果见表3。

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

由表3可知，模型的P值为P＜0.000 1，表明回归模型方差显著，拟合度较好；失拟项的P值为0.082 4＞0.05，不显著，说明该模型与实际试验拟合较好，能较好地预测结果[20-21]。故响应面方法对枸杞面酱的制备工艺的优化合理可行。

一次项 A、B、C 以及二次项 A2、B2、C2、D2均表现为显著，由此可知这些一次和二次项对枸杞面酱发酵的影响较为明显；在模型一次项中，D的显著性较差，说明发酵时间对枸杞面酱的发酵影响较小；而在模型交互项中，AB、AC、AD、BC、BD、CD 交互项的显著性均较差，说明发酵与单因素并不是简单的线性关系。方差分析可知，试验所选因素对响应值影响的强弱次序依次为：枸杞添加量＞发酵温度＞发酵剂接种量＞发酵时间。

2.2.2 响应面结果优化与分析

根据Design Expert 8.0.5 b软件，做出各因素对枸杞面酱中氨基酸态氮含量的响应面分析图及等高线图，其结果见图5。考察所拟合的响应面形状，分析各因素及其交互值对响应值的影响、变化趋势以及各因素在所选范围内存在的极值。

图5 各变量互相作用对枸杞面酱中氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects on the content of amino nitrogen in wolfberry flour paste

图5中响应面上标记的最高点即为最大值，说明在所选分析的因素水平范围内存在极值。等高线的形状可反映交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则相反[22]。枸杞添加量与发酵时间比发酵剂接种量和发酵时间的交互作用显著，而发酵剂接种量和发酵时间比枸杞添加量与发酵温度的交互作用显著，说明枸杞添加量、发酵时间和发酵剂接种量这3个因素对枸杞面酱中氨基酸态氮的含量影响较大。

2.2.3 验证试验

依据Design Expert 8.0.5b软件对响应面试验进行优化分析，得到最佳工艺条件：枸杞添加量为8.35%，发酵剂接种量为0.31%，发酵温度为51.71℃，发酵时间为21.15 d，氨基酸态氮的理论值为0.793 g/100 g。考虑实际操作条件，将上述最佳发酵条件修正为：枸杞添加量8.5%，发酵剂接种量0.3%，发酵温度50℃，发酵时间21 d。该条件下平行3次测得枸杞面酱中氨基酸态氮含量为0.789 g/100 g，相对误差为0.5%，说明此次响应面分析法优化后所得到的枸杞面酱的发酵条件较为准确可靠，具有一定的实际应用价值，可为制备特色面酱提供新的参考。

3 结论

本文在单因素试验基础上，以枸杞面酱的氨基酸态氮含量为考查指标，通过响应面法结合Box-Benhnken Design模型的分析，对枸杞面酱的制备工艺进行了优化，进一步得到最优的工艺条件：枸杞添加量8.5%，发酵剂接种量0.3%，发酵温度50℃，发酵时间21 d。该条件下测得枸杞面酱中氨基酸态氮含量为0.79 g/100 g，相对误差为0.4%。利用枸杞制备的面酱，不仅具有枸杞清香，还可以增加面酱中氨基酸态氮的含量，改善面酱的风味和品质，提高枸杞的附加值。