白介素-17、转化生长因子-β1在烟雾暴露大鼠肺组织中的表达及与肺血管重塑的关系

熊玮 曾玉兰 周薇

有研究表明,COPD早期阶段病人和没有气流受限的吸烟者均可发生肺血管改变[1]。肺血管重塑过程分子机制复杂，其中TGF-β1在血管张力和增殖的控制上扮演着重要角色[2]。Th17细胞是一种拥有独立分化机制的新型 CD4+效应 T 细胞，在COPD、哮喘等慢性炎症性疾病和多种自身免疫性疾病中均有重要作用。IL-17是 Th17 细胞的主要效应因子。已有研究证明，低压低氧可致Th17细胞在肺组织中增多，在肺血管与心肌结构重塑中发挥重要作用[3]。转化生长因子-β1(TGF-β1)和IL-6共同作用，诱导了Th17细胞的分化。Smads蛋白家族参与TGF-β1的细胞内信号转导，其中Smad2/3是TGF-β通路信号下传的第一个信号分子。本研究通过建立香烟烟雾暴露大鼠模型进行观察，并进一步加入药物干预，以期探讨IL-17、TGF-β1及TGF-β/Smad通路在肺血管重塑中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级健康雄性 7周龄SD大鼠72只，体质量(210±10)g(由华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年医学研究所动物实验室饲养);CY-100B 数字测氧仪，兔抗 TLR-4 多克隆抗体、小鼠抗PCNA 单克隆抗体、PV600免疫试剂盒(武汉谷歌生物公司);奥林巴斯光学显微镜(日本奥林巴斯公司);HMIAS-2000 彩色图文分析系统(武汉千屏影像公司)。

1.2 实验模型制备及动物分组 参照文献[4]制备大鼠被动吸烟装置，烟熏箱大小为 100 cm×65 cm×45 cm，每侧各留9个直径2.5 cm的通气孔。大鼠适应性喂养7 d无异常后随机分为对照组(S1组)、烟雾暴露组(S2组)、烟雾暴露+药物干预组(S3组)，每组各 24只。S1组大鼠置于小铁笼内，自由呼吸空气，除常规喂养外不做其他处理；S2、S3组大鼠在规定烟雾暴露时间内放置于烟熏箱内，每次使用10支香烟捆扎为一组后点燃并置于烟熏箱中的支架上，香烟采用武汉市售红金龙牌香烟，每支焦油含量为15 mg。用 CY-100B数字测氧仪进行监测，烟熏箱中的氧浓度保持在 20%～21%之间，根据监测结果开放烟熏箱的通气孔；大鼠每天烟雾暴露2次，每次30 min，2次暴露时间间隔4 h。香烟烟雾暴露间隔期间将大鼠置于正常无烟环境中饲养，任其自由活动、饮食。同时，S3组大鼠于第5周起每次烟熏后腹腔注射Smad3抑制剂SB431542，2次/d，直至第12周。Smad3抑制剂(SB431542)以二甲基亚砜(DMSO)溶解，使用前将SB431542溶解在2%DMSO+30%聚乙二醇300+双蒸水中，浓度为5 mg/mL，每次使用剂量为5 mg/kg，2次/d。如出现死亡则终止实验。S1、S2、S3组分别于第8周、第12周随机处死12只大鼠。

1.3 病理标本制作 各组大鼠到达造模时间干预点后，用1%戊巴比妥钠(90 mg/kg)进行麻醉，眼球取血法取血，制备血清。放血处死后开胸，分离出肺脏，取左肺用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，行石蜡包埋，病理切片机切片，切片厚度约4μm。

1.4 肺血管苏木精-伊红(HE)染色及病理学观察 病理切片用HE染色法染色，在光学显微镜下观察各组大鼠肺泡和肺血管的病理学情况，每张切片随机选取结构较完整、横断面较圆且直径约为50～200μm 的肺动脉 5 支，分别测量内外径、血管面积及管壁厚度，以图文分析仪测量并记录管壁面积/血管总面积(vascular wall area/total vascular area，WA%)和血管壁厚度/血管外径(vascularwall thickness/vascular external diameter，WT%)。

1.5 IL-17检测 采用免疫组化法检测大鼠肺组织中IL-17表达水平，ELISA法测定血清中 IL-17 的含量。IL-17免疫组化试剂盒均由美国 Santa Cruz 公司生产。IL-17一抗为山羊抗大鼠 IL-17 单克隆抗体，1∶70稀释。阴性对照均用PBS代替。染色步骤按说明书进行。以显微镜400倍视野下，随机5个视野阳性染色积分光密度(IOD)均值反映IL-17表达量。

1.6 Smad3检测 采用免疫组化法检测肺组织中Smad3的表达水平，用链霉亲和素过氧化物酶 (SP)法进行。微波加热法修复抗原，DAB显色。试剂盒购自博士德生物制品有限公司，Smad3抗体浓度为1∶200。以5个视野IOD均值反映Smad3表达量。

1.7 TGF-β1检测 采用PV6000二步法免疫组化染色法检测肺动脉组织TGF-β1的表达水平，按照试剂盒说明书进行操作，每张切片在 400 倍视野下随机采集5条直径100～200μm的动脉，采集图像，测定每个视野下阳性染色动脉的吸光度(A)，进行定量分析。

2 结果

2.1 动物的一般情况 实验开始前，各组动物活动、饮食情况良好，活动敏捷。在整个实验过程中未见死亡小鼠。实验动物每日给予充足定量饲料，观察每日饲料剩余量。与S1组比较，8 周及12周时，S2动物活动度明显下降，反应迟钝、饮食量下降；S3组活动度下降，反应迟钝，饮食量下降，但较S2组程度减轻。

2.2 HE染色观察肺组织的病理形态学改变 对照组肺动脉壁较薄，结构正常。S2组及S3组随烟雾暴露时间延长，气道和血管周围炎性细胞浸润逐渐加重，肺血管壁逐渐增厚。但未见肺气肿改变。见图1。

肺血管重塑定量分析观察指标：S1组8周与12周的WA%和WT%值无明显差异。S2组8周和12周的WT%、WA%值均较同期S1组显著增加，S2组12周时肺动脉壁厚度明显大于8周时，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。S3组8周及12周时的WA%和 WT%值分别高于同期S1组，但低于同期S2组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A：S1组8周时；B：S1组12周时；C：S2组8周时；D：S2组12周时；E：S3组8周时；F：S3组12周时 图1 各组大鼠肺组织病理形态学改变(HE染色，×200)

2.3 各组小鼠肺动脉组织TGF-β1的表达水平比较 S1组8周及12周时肺动脉无 TGF-β1 阳性染色，S2组8周及12周时肺动脉平滑肌细胞胞浆 TGF-β1强阳性染色。S3组8周及12周时肺动脉平滑肌细胞胞浆 TGF-β1强阳性染色。见图2。S2组8周、12周时，TGF-β1蛋白相对表达量均较同期S1组显著增加(P<0.05)，且12周时明显高于8周亚组(P<0.05)。S3组8周及12周时TGF-β1蛋白相对表达亦明显高于同期S1组(P<0.05)，但与同期S2组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4 肺组织IL-17、Smad3表达水平比较 S2组肺组织IL-17、Smad3表达水平随烟雾暴露时间延长而增加，且较同期S1组增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)。S3组8周及12周时，肺组织IL-17、Smad3表达较同期S2组减少，但较同期S1组增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A：S1组8周时；B：S1组12周时；C：S2组8周时；D：S2组12周时；E：S3组8周时；F：S3组12周时 图2 免疫组化法检测肺动脉组织TGF-β1的表达水平(DAB 显色，×200)

2.5 血清中 IL-17 的水平比较 S2组血清IL-17水平随烟雾暴露时间延长表达增加，且较同期S1组增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。S3组8周及12周时，血清IL-17水平高于同期S1组(P<0.05)，但低于同期S2组(P<0.05)。见表1。

表1 各组肺血管重塑指标及免疫组化检测指标比较

2.6 TGF-β1与WA%、WT%及肺组织IL-17、Smad3的相关性分析 肺动脉中TGF-β1表达水平与WA%、WT%(r=0.797、0.901，P<0.01)以及肺组织IL-17、Smad3(r=0.479、0.891，P<0.01)表达水平均呈正相关。

3 讨论

肺血管重塑是肺动脉内膜、中膜和外膜共同增厚的过程。香烟烟雾可以直接作用于肺血管，在未发生缺氧、肺功能下降和肺血管床损毁的情况下，即可引起肺血管重塑，但具体机制尚不完全明确。

龙翔等[5]研究发现，吸烟的COPD病人及吸烟的肺功能正常人群肺组织中的IL-17信使RNA 的相对表达量及 IL-17细胞因子均较未吸烟者增高。在对低压低氧复制缺氧性肺动脉高压(PAH)大鼠的研究中发现，低压低氧后，大鼠肺组织及血清中IL-17表达水平增高，分析认为低压低氧后，Th17细胞在肺组织中增多，导致肺组织 IL-17水平增高，IL-17可以刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞表达内皮细胞黏附分子1等黏附分子，并能增强血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等生长因子的促增殖作用，共同参与肺血管重塑[3]。IL-17能募集及活化中性粒细胞，促进T细胞活化及刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生细胞因子，从而介导组织炎症反应，促进新生血管的生成[6]。IL-17是 Th17 细胞的主要效应因子。Th17细胞的分化需要TGF-β信号的参与。

TGF-β1具有重要的免疫调节和致纤维化活性，故而在气道炎症及气道重塑中占重要地位[7]。其存在于所有的哺乳动物中，上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞等细胞都能够合成并释放TGF-β1。研究表明，在炎症反应明显的COPD大鼠中,其肺小动脉的内皮细胞和平滑肌细胞TGF-β1表达增高[2]。吸烟也可以导致大鼠气道上皮细胞 TGF-β1表达明显升高，而且香烟烟雾刺激时间越长，TGF-β1表达越多[8]。

本实验通过建立烟雾暴露大鼠肺血管重塑模型，经HE染色观察到烟雾暴露后各组大鼠肺血管都发生了不同程度的炎症浸润及管壁变形、增厚，管腔狭窄等，其中以吸烟 12周的小鼠血管的改变最为明显。通过计算血管重塑的客观指标(WA%和WT%)，证实肺血管重塑随烟雾暴露时间延长而逐渐加重，肺血管重塑程度与烟雾暴露时间呈正比。而随烟雾暴露时间延长，大鼠肺组织及血清中IL-17表达亦增高，肺组织中Smad3表达增加，与肺动脉组织中TGF-β1表达呈正相关；肺动脉组织中TGF-β1表达增高，与肺血管重塑水平呈正相关。表明IL-17、Smad3、TGF-β1在肺血管重塑中起重要作用。在一项对COPD病人的研究中同样发现，COPD病人的血清、肺泡灌洗液中IL-17的含量均明显增高，表明IL-17可能在COPD的病理进程中发挥重要的作用[9]。加入Smad3抑制剂进行干预后，肺血管组织中TGF-β1未明显减少，但血清IL-17及肺组织中IL-17明显减少，肺血管重塑程度较同期S2组减轻，表明在IL-17、TGF-β1参与的肺血管重塑过程中，TGF-β/Smad3通路起重要作用。

TGF-β发挥生物学效应主要依赖于其下游高度保守的胞内信号蛋白-Smads蛋白家族介导的信号传递,TGF-β通过激活其受体的Smad2和Smad3，联合核转录因子来调控基因转录。作为TGF-β1的下游信号，Smad3是参与 COPD发病的关键性细胞因子。野百合碱PAH模型大鼠肺动脉中，TGF-β1、磷酸化Smad3 蛋白表达明显升高，Smad3 磷酸化水平显著增高，证实在PAH大鼠肺动脉中TGF-β/Smad3信号通路呈显著活化状态，参与大鼠PAH的发生发展过程[10]。SB431542为特异性ALK5抑制剂，即TGF-β受体Ⅰ的抑制剂，可以抑制ALK5激活对下游信号分子Smad2/3的磷酸化，从而阻断依赖Smad 途径。本次实验表明，使用SB431542能减少IL-17表达，减轻肺血管重塑程度。但肺血管重塑发病机制复杂，可能有多种信号通路参与其中，Smad信号通路是其中途径之一。在肺纤维化发病机制中，TGF-β1 还可能诱导非Smad信号通路。

综上所述，烟雾暴露大鼠肺组织中IL-17、肺血管组织中TGF-β1表达明显增高，通过多种途径参与肺血管重塑过程，其中Smad3在促进IL-17表达及肺血管重塑中起重要作用，SB431542通过阻断TGF-β/Smad通路可能减轻肺血管重塑程度，可能为今后COPD、肺血管疾病的治疗提供方向。但本研究未对SB431542的使用剂量进一步探讨，使用抑制剂的不良反应需长期观察。而且IL-17参与肺血管重塑可能存在多种途径，仍需进一步研究。