牛乳酪蛋白及其水解物的纳米金荧光增强检测方法

薛海燕，薛丽欢，贺宝元，樊娇娇，李晶莹

（陕西科技大学a.食品与生物工程学院，b.轻工科学与工程学院，西安 710021）

0 引 言

酪蛋白（Casein,简称为CN）是乳中含量最高的蛋白质[1]，是一类富含赖氨酸的结合蛋白。酪蛋白中包含多种人体必需的氨基酸，其经水解可产生如ACE 抑制肽、抗氧化肽、抗疲劳肽等功能肽段[2]。但婴幼儿难以消化酪蛋白，随着市场配方婴幼儿乳粉的价格增高，部分厂商在乳清粉中掺入水解酪蛋白，会对婴幼儿的健康造成损害。目前国内外研究酪蛋白检测技术有相关报道，程涛、孙艳波等人采用双缩脲法测定牛乳中酪蛋白含量[3]，将其作为一种判定牛乳质量的指标；J Belloque[4]等人用31P-NMR 技术测定牛奶中酪蛋白含量；B Vallejo[5]等用毛细管区带电泳技术分离和测定牛乳中的主要酪蛋白和乳清蛋白；G Anguita等[6]用竞争ELISA 检测羊乳及羊乳制品中掺杂的牛乳，使用的是牛乳β-酪蛋白单克隆抗体，可检测出掺杂率在0.5%～25%范围的样品。而关于酪蛋白及其水解物的检测方法报道较少，因此，需建立一种操作简单，快速准确且灵敏度高的检测方法。

近年来，纳米金表面增强荧光(surfaceenhancedfluorescence, SEF)的研究越来越受到人们的重视。在荧光检测分析中常用异硫氰酸荧光素( FITC) 作为荧光探针，因其量子产率高，有较好的光稳定性和较低温度系数[7]。在碱性条件下，FITC 分子中的异硫氰基可直接与蛋白分子中的氨基( 主要为赖氨酸的ε-NH2) 经碳酰化反应形成硫碳氨基键，实现荧光蛋白标记[8]。目前主要利用纳米粒子淬灭荧光对核酸、蛋白质进行定性定量研究,但是通过液相中的荧光增效行为的研究很少。司民真等[9]在溶液中利用金属银纳米粒子可以增强染料分子的荧光, 并研究了银纳米粒子电性和荧光增强的关系。余林海[10]等研究表明纳米金对荧光素的荧光效率具有增强作用, 其增强效果取决于纳米金的尺寸大小和浓度。李慧等[11]研究基于核酸杂交的原理建立了纳米银聚合探针的检测方法，实现了荧光信号放大的作用，并成功应用于人IgE 的高灵敏分析检测。张晓红等[12]利用DNA 聚合和银纳米结构的增强荧光效应检测凝血酶的检测范围为0～1.0 μmol/L，检测限是9.3 nmol/L。王睿等[13]通过条件优化建立纳米金-罗丹明B体系的荧光增强法测定硫酸阿米卡星的线性范围为7.80×10-6～1.25×10-4mol/L，检出限为2.2×10-6mol/L。贾佳等[14]建立食品中痕量TBHQ 的金纳米粒子荧光增强测定法，在最佳检测条件下金纳米荧光强度与TBHQ 在0.13～1.7 mg/kg 浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数R2为0.995，检出限为0.12 mg/kg。Park 等[15]通过静电吸引与Cy3 共轭的适体固定在纳米金上，实现荧光发射增强，其荧光强度变化与凝血酶浓度从10 μmol/L 到10 pmol/L成正比。Nam 等[16-18]以检测抗体和巯基寡核苷酸修饰纳米金形成纳米金探针，通过银染反应检测蛋白质含量，或者用荧光基团修饰纳米金探针上的巯基寡核苷酸，通过荧光检测测定蛋白质含量。

本文利用金纳米粒子的荧光增强作用，在其表面结合酪蛋白抗体，然后将FITC 标记于CN 分子游离的NH2（主要是赖氨酸的ε- NH2）特异性结合，二者结合后使体系荧光增强。原理如图1 所示，当待检物含有CN 时，竞争性地使体系荧光减弱，当待检物不含有CN 时，外来抗原无法与酪蛋白抗体结合，从而使体系的荧光强度不发生变化。所以根据检测荧光强度的变化可以实现对待测CN 及其水解物的检测。

图1 纳米金荧光增强法检测CN

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

牛乳酪蛋白，胃蛋白酶，胰蛋白酶均为美国sigma公司；30 nm 的金纳米粒子，上海杰一生物技术有限公司；FITC，96 孔板，美国康宁公司；透析袋，上海源叶生物科技有限公司；生理盐水，辰欣药业股份有限公司；PEG 20000/6000，美国sigma公司。

1.2 实验仪器

全波长功能读数仪，赛默飞世尔科技有限公司；超滤仪，美国millipore 公司；酶标板（聚苯乙烯板）96孔，北京鼎国生物技术有限公司；微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂；Smart系列超纯水仪，力康生物医疗科技控股有限公司；移液枪，德国Brand公司。

1.3 实验方法

1.3.1 CN-FITC 的制备及标记率检测[19]

1.3.1.1 荧光标记牛乳酪蛋白

称取牛乳酪蛋白20.0 g，溶于1 000 mL pH 9.5 的PBS缓冲液中，超声30 min后于磁力搅拌器上搅拌1 h至酪蛋白完全溶解，向酪蛋白溶液中添加0.2 mg 的FITC，超声30 min 后于磁力搅拌器上搅拌1 h，静置于4 ℃冰箱中反应24 h，调节其pH 至4.6，于4 ℃，5 000 r/min 离心30 min，3 次，弃去上清，除去没有与酪蛋白结合FITC，将样品再次溶解，通过1 ku 的超滤膜超滤再次去除残留FITC，此过程重复3 次，使用透析袋透析24 h，每4 h 换一次透析液，宽度36 mm，MW：8 000-14 000，将所得样品进行冷冻干燥后，保存于4 ℃的冰箱中。

1.3.1.2 荧光标记率的检测

称取3 mL 酪蛋白、FITC-酪蛋白溶液分别在280 nm、495 nm 处测吸光值，以酪蛋白溶液为空白对照组，均做三个平行。依相关公式计算FITC-酪蛋白的荧光标记率[20]。

F/P：FITC 与酪蛋白的比值，即每mg 酪蛋白所标记的μg FITC 的比值；

OD280 nm、OD495 nm：FITC-酪蛋白在波长为280 nm、495 nm 检测的吸光光度值。

1.3.2 Gold-IgG 的制备

参照薛海燕等[21]的方法，取1 mL，浓度为5.0×10-10mol/L的胶体金溶液，0.1 mol/LK2CO3溶液调至最佳标记pH 为8.0，按最佳蛋白标记量加入抗体蛋白10 μL，漩涡振荡，充分混匀后于4 ℃，10 000 r/min 离心15 min，3 次，弃上清，沉淀用免疫金稀释液复溶至原体积的1/10，4 ℃避光保存备用。

1.3.3 Gold -IgG 和CN-FITC 最佳比例标记

将上述制备的gold-IgG 溶液中分别加入10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL casein-FITC 溶液，于37 ℃孵育1 h，在4 ℃，13 000 r/min 离心15 min，3 次，弃上清，沉淀用pH 为7.5，含有1%PEG 的PBS 缓冲溶液洗涤，平行实验三次，确定最佳标记比例。

1.3.4 紫外可见吸收光谱表征

取纳米金及标记好的Gold-IgG 和Gold-IgGCN-FITC 进行400～700 nm 紫外可见全波长扫描，观察峰强度、峰位移及半峰宽的变化。

1.3.5 纳米金荧光增强检测方法的建立

1.3.5.1 酪蛋白检测方法的建立

用pH为9.0的PBS分别配制0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL 的酪蛋白溶液，超声30 min 后于磁力搅拌器上搅拌1 h 至酪蛋白完全溶解，吸取100 μL 添加于96 孔板进行检测，使用全波长功能读数仪测定其荧光强度。测定条件如下，激发波长为495 nm，扫描发射波长范围为500～700 nm，电压为400V，狭缝宽度均为10 nm。各相应浓度抗原的RFU 值为B，以log10（B）值为纵坐标，以相应浓度值为横坐标，制作标准曲线，根据标准计算待测抗原浓度。

1.3.5.2 对酪蛋白胃肠水解物标准溶液的检测

称取1 mg/mL 的FITC-酪蛋白溶液一份，用6 mol / L HCl 将pH 调节至2.0，在37 °C 下孵育10 min，加入100 mg / mL 胃蛋白酶0.2 mL，于37 °C 下体外模拟消化震荡1 h 后停止反应，用2 mol / L 氢氧化钠溶液将体系的pH 调节至7.0，加入100 mg/mL 0.12 mL 胰蛋白酶和脱氧胆酸钠，于37 °C 匀速震荡，取2 h后的胃肠消化液进行检测。

1.3.6 重复性试验

分别取3 个已知浓度的酪蛋白标准品及其胃肠水解物，按所建立的纳米金荧光增强检测法分别进行批内、批间检测的可重复性试验。批内试验检测，每个浓度设三个重复；批间试验进行3 次独立检测，每次间隔10 d，计算所测得荧光的平均值和变异系数（CV）。

1.3.7 数据统计分析

用Origin 软件作图并用SPSS 9.0 进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 FITC 标记牛乳酪蛋白及荧光标记率的检测

2.1.1 FITC-CN 的纯化结果

图2 FITC-CN体系游离荧光检测

由图2 可知，对FITC-CN 标记体系中游离荧光检测可知，FITC-CN 溶液经过一次超滤后滤液中荧光强度为186.80 RFU，两次超滤后滤液荧光强度单位为62.53 RFU，表明已除去大部分游离荧光素，3 次超滤后滤液的荧光强度明显减少，为20.67 RFU，表明除去游离荧光素效果明显。3 次超滤后透析，检测其滤出液几乎无游离荧光素的存在。表明超滤透析纯化后FITC-CN 可用于后期实验研究。

2.1.2 荧光标记率的检测

FITC 可与酪蛋白中的氨基结合形成稳定的共价键，从而实现对酪蛋白的荧光标记。由表1，根据标记率公式，测得F/P=1.35，在1-2 之间，由文献[22]知，蛋白质被充分标记，比较成功。

表1 FITC-CN不同波长条件下吸光光度值

2.2 紫外-可见吸收光谱表征结果分析

图3 纳米金颗粒标记前后紫外可见光光谱扫描图

图3 为纳米金标记前后的紫外-可见全波长扫描，当金纳米粒子连接上抗体IgG，体系的最大吸收波长由523 nm 红移到530 nm，且峰宽基本无变化，说明gold-IgG 标记结果稳定可靠；当最后连接上CN-FITC 后，由于金纳米粒子和荧光素的吸收峰的重叠，而导致了紫外吸收峰明显的变宽和红移。M 等人研究表明金纳米粒子由于表面等离子共振引起的紫外可见吸收峰宽，与大部分荧光分子供体都有较好的重叠[23]。紫外吸收峰的变化表明，一系列的生物分子都已经连接了在金纳米粒子上。

2.3 检测条件的优化

2.3.1 抗原最佳量的选择

图4 不同浓度CN-FITC对体系荧光增强检测

如图4 所示，本实验使用粒径为30 nm 的纳米金，在已标记好的Gold-IgG-CN-FITC 体系中，固定荧光素浓度为0.1 mg/mL，分别加入1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL 的CN，其引起荧光增强的临界点分别为1、10、20 μg/mL。这证明粒径相对较小的纳米金对荧光增效的效果较好。结果如图5 所示，随着CN 浓度的增大，体系的荧光强度逐渐增强，当浓度达到30 μg/mL 时，体系荧光强度达到最大值，继续增大抗原浓度，体系荧光强度逐渐减弱甚至猝灭，由此得出建立体系的最佳CN-FITC 浓度为30 μg/mL，即抗体∶抗原=1∶3。根据理论[24],荧光通常是发生在具有刚性结构和平面结构的电子共扼体系分子中,随着电子共扼度和分子平面度的增加,荧光量子产率也将有很大程度的增加。荧光增强是指任何可以使某种给定荧光物质的荧光强度增加的作用或任何可以使荧光量子产率增加的作用。在Gold-IgG-CN-FITC 体系中，一方面由于金纳米粒子表面结构发生改变使体系的荧光强度增强；另一方面激发态复合物的存在也有效避免了分子间的碰撞,或加强了荧光分子的刚性结构,降低表面缺陷,从而增强了体系的荧光强度。

图5 不同浓度抗原的纳米金荧光增强法检测

2.4 CN 标准曲线的建立

纳米金荧光增强法检测蛋白质先是利用纳米金可以与生物分子非共价结合的特性将抗体标记于纳米金表面，然后再利用抗原抗体特异性反应将CN-FITC 非共价结合，根据纳米金荧光增强效应，使标记体系荧光达到最大，最佳标记体系中加入待检抗原，待测抗原和荧光标记抗原竞争与金标抗体结合，则体系荧光强度随着待测抗原浓度的增加而降低，即呈反比。

图6 纳米金荧光增强法检测CN

图7 纳米金荧光增强法检测CN的标准曲线

2.5 酪蛋白胃肠水解物的检测

稀释5 份已知酪蛋白胃肠水解物浓度用纳米金荧光增强法检测，将两者检测值对比，检测结果如表2，表明两者基本一致，说明该方法可应用于牛乳酪蛋白胃肠水解物的相应检测。

表2 酪蛋白胃肠水解物检测

2.6 酪蛋白胃肠水解物标准曲线的建立

图8 纳米金荧光增强法检测酪蛋白胃肠水解物

图9 纳米金荧光增强法检测酪蛋白胃肠水解物的标准曲线

如图8 图9 所示，利用该方法检测酪蛋白胃肠水解物绘制的标准曲线，随着酪蛋白水解物浓度的增大，体系荧光强度逐渐减弱，并在一定浓度范围内呈线性关系，如图9 所示，线性方程为y= -0.67x+5.61，相关系数R2=0.998 ，线性关系良好，该方法对酪蛋白胃肠水解物检测限为0.2 μg/mL。

2.7 重复性实验结果

各取3 个已知浓度的标准酪蛋白和酪蛋白胃肠水解物，分别做3 个组内重复和组间重复试验，结果如表3 表4 所示，CN:批内试验变异系数为2.73%～4.33%，批间试验变异系数为2.45%～4.56%；酪蛋白胃肠水解物：批内试验变异系数为3.30%～5.62%，批间试验变异系数为3.06%～5.97%，均小于6%，表明所建立的纳米金荧光增强竞争法对CN 及其胃肠水解物检测均具有良好的可重复性。

表3 纳米金荧光增强法检测CN的重复性

表4 纳米金荧光增强法检测酪蛋白胃肠水解物的重复性

3 结 论

纳米金标记对生物分子的活性影响较小，且能标记很大一部分生物分子，是非常理想的标记物。纳米金具有独特的理化特性，纳米金标记蛋白质一般是通过物理吸附标记的。标记原理是蛋白质溶液在其pH值等于或稍高于该蛋白质的等电点时呈现电中性,此时蛋白质分子与纳米金相互间的静电作用较小,但蛋白质分子的表面张力却最大,处于一种微弱的水化状态,较易吸附于纳米金表面。纳米金对蛋白质等生物大分子有很强的吸附作用,而且这种吸附作用不会使其变性[25],因此在免疫分析方面有很好的应用前景。

本研究中，纳米金探针标记抗体的同时还标记了带有荧光信号的蛋白分子，荧光探针捕获检测待测蛋白后与纳米金探针结合形成竞争体系,从而将待测蛋白质的检测转化为对抗原标记荧光分子的检测。这种方法通过一个纳米金上有荧光标记的蛋白分子，将蛋白质检测信号放大,提高了蛋白质检测的灵敏度，纳米金承担了信号放大载体的角色。

纳米金荧光增强法检测CN 标准曲线的线性范围在0.2 μg/mL 到1μg/mL，R2为0.991，最低检测限为0.2 μg/mL，而传统的间接竞争ELISA 法检测酪蛋白的检测限为10 μg/mL，故该检测方法对酪蛋白的检测具有较低检测限。原因可能是当抗体标记于纳米金表面时，非特异性吸附颗粒比抗体单独存在时更加易于洗去，从而降低了背景信号，即有利于获得更高的检测信号[26]。目前关于酪蛋白在胃肠生理环境条件下检测其浓度尚未有研究报道，本实验建立了一个初步的检测方法，酪蛋白胃肠水解物标准曲线的线性范围在0.2 μg/mL 到1 μg/mL，R2为0.998，最低检测限为0.2 μg/mL。

综上，以金纳米粒子为基础结合荧光光谱分析，实现了简单且高灵敏度的对酪蛋白及其水解物的检测。实验结果表明，这种方法对酪蛋白及其水解物的检测具有较低检测限和相对较大的线性响应范围，本实验对溶液中酪蛋白及其胃肠水解物的识别浓度低至0.2 μg/mL。我们选择标准的生物分子识别体系来建立这种新的分析方法，但这种新型分析方法也适用于实际应用中酪蛋白的高通量检测。