降解柴油嗜盐菌的筛选、鉴定及其降解特性

高文静，肖丽娇，王顺民，韩秋霞

(山东科技大学 化学与环境工程学院，山东 青岛 266590)

柴油是石油炼制过程中产生的轻质石油产品，是复杂烃类的混合物[1]，柴油导致的污染是世界各国普遍关注和需要面对的环境问题，生物法治理柴油污染具有成本低和安全等优点[2]，成为柴油污染治理的常用方法。然而，柴油污染常伴随着高盐环境，采用一般的生物处理法处理柴油污染时，高浓度的盐离子会妨碍微生物的生长及其对柴油的降解，影响处理效果[3]。因此，研究能耐受一定盐浓度的柴油降解菌，对柴油污染而形成的盐渍化土壤和高盐度的柴油废水进行生物修复具有重要的指导意义[4]。吴涛等[3]从被柴油污染的土壤中筛选到一株耐盐柴油降解菌BM38，在高盐环境下能降解柴油。目前尚未见专门针对盐场区域的柴油降解菌的研究[5]。

柴油降解的第一步是以某种方式将碳氢化合物从油相输送到细胞表面，从而实现有效的细胞表面接触，并最终实现跨细胞膜的有效输送[6]。但是柴油大部分组成成分不溶或难溶于水，使得微生物不能与之充分接触，成为微生物治理环境污染的一大阻碍。生物表面活性剂是由微生物细胞代谢产生的一类具有表面活性的产物[7]。有关分析认为，向纯培养物中添加生物表面活性剂能促进多种碳氢化合物的生物降解[8]，其主要通过增加烃类物质的溶解度和提高生物利用率2个途径来提高微生物对柴油的降解[9]。然而，通过微生物发酵产生提取到的生物表面活性剂产量有限，很难通过投加大量生物表面活性剂来提高柴油降解率，因此，需要筛选高产生物表面活性剂的嗜盐菌，将其与柴油降解菌配合投加来处理柴油污染，以加快柴油的生物降解，但目前关于耐高盐的复合菌系降解特性的研究较少[10]。

本研究从盐场分离纯化得到的145株嗜盐菌中筛选出1株高产生物表面活性剂嗜盐菌B-2和1株高效柴油降解嗜盐菌B-18，对菌株进行鉴定和降解碳链烃类的特性研究，同时研究其降解特性构建复合菌系，确定最适柴油降解条件，并通过扫描电镜观察研究降解柴油前后菌体的形态变化，以期为高盐环境下柴油污染的生物修复和工业化菌剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

菌株分离自山东昌邑盐场(37°02′2.48″N，119°22′18.12″E)NaCl质量体积分数为12%～26%的晒盐水，分离纯化得到145株嗜盐菌。

1.2 培养基

Gibbons培养基(GM)：NaCl 100.0 g，酵素水解物5.0 g，酵母浸出物10.0 g，柠檬酸钠3.0 g，MgSO4·7H2O 20.0 g，KCl 2.0 g，加蒸馏水至1 L，pH 7.0。

无机盐培养基(MSM)：FeSO4·7H2O 2.5×10-5g，(NH4)2SO410.0 g，KH2PO43.4 g，K2HPO44.4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.11 g，EDTA 1.0 g，NaCl 100.0 g，加蒸馏水至1 L，pH 7.0，添加体积分数3%柴油(0#柴油)作为唯一碳源。

血平板培养基：蛋白胨10.0 g，NaCl 100.0 g，牛肉粉3.0 g，琼脂20.0 g，加蒸馏水至1 L，pH 7.0，灭菌后冷却至50 ℃，加入50 mL无菌脱纤维羊血摇匀后倒平板。

1.3 菌株筛选与生物学特性分析

1.3.1 柴油降解菌的分离筛选

将实验室保藏的145株嗜盐菌单菌接种于以体积分数3%柴油为唯一碳源的MSM中，37 ℃，200 r·min-1恒温摇床培养120 h，选取长势良好的菌株作进一步研究。

1.3.2 柴油降解率的测定

柴油浓度的测定采用紫外法[11]，待测嗜盐菌接种于含有体积分数3%柴油的MSM中，37 ℃、200 r·min-1摇床培养120 h后，加入10 mL石油醚(60～90 ℃沸程)萃取发酵液中未降解的柴油，萃取液8 000×g冷冻离心10 min，加入无水硫酸钠除水，过滤至25 mL容量瓶中，用石油醚定容，754紫外可见分光光度计测定柴油残油量。

式中：m0是空白培养基柴油的质量；m1是实验培养基柴油的质量。

1.3.3 生物表面活性剂初筛

选择长势良好的嗜盐菌株接种于以体积分数3%柴油为唯一碳源的MSM中，37 ℃，恒温摇床培养96 h后，将发酵液离心得上清液。取直径为90 mm的培养皿，加入20 mL蒸馏水，在蒸馏水表面滴加200 μL经苏丹Ⅲ染色的液体石蜡形成油膜，在油膜中心小心滴加200 μL上清液，形成排油圈，测定排油圈的直径[12]。

将菌株点种到血平板培养基上，37 ℃培养2～3 d，观察单菌落周围有无透明的溶血圈，确定是否有表面活性物质产生[13]。

将柴油降解菌接种到含有体积分数3%柴油的MSM中发酵，以不接菌的培养基作为空白对照，37 ℃培养96 h，将发酵液离心得上清液，室温下用JK99B全自动张力仪测定菌液表面张力。

1.4 菌株鉴定

通过形态学观察[14]和16S rRNA序列分析，对所得菌株进行鉴定。将嗜盐菌株送交到生工生物工程(上海)股份有限公司测定，把测序结果在NCBI数据库中进行同源性比较，获得与实验菌株序列相似的其他相关菌株的16S rRNA序列。用MEGA version5软件构建系统发育树。

1.5 柴油降解菌降解柴油组分的GC-MS测定

将柴油降解菌接种到以体积分数3%柴油为唯一碳源的MSM中，培养5 d后提取剩余柴油组分，进行GC-MS测定(安捷伦，HP-5MS柱)，检测柴油的降解情况。色谱条件：高纯度氦气(99.999%)，进样口温度290 ℃，平衡时间为0.25 min，进样量1 μL，程序升温条件：起始温度100 ℃(维持2 min)，以10 ℃·min-1升温至300 ℃，维持10 min。

1.6 影响柴油降解因素实验

1.6.1 柴油单一碳源实验

将菌株接种到以柴油为唯一碳源的MSM中，摇床37 ℃、200 r·min-1培养96 h。初始柴油体积分数分别设置为5%、10%、15%，每12 h测定菌体浓度和柴油降解率。

1.6.2 单菌株柴油降解实验

将菌株接种到GM中，摇床37 ℃、200 r·min-1培养48 h后分别加入体积分数5%、10%、15%、20%、30%、40%的柴油，摇床37 ℃、200 r·min-1振荡培养，每12 h测定柴油降解率。

1.6.3 复合菌株柴油降解实验

将高产生物表面活性剂嗜盐菌与高效柴油降解菌接种到GM中，摇床37 ℃、200 r·min-1混合培养48 h后分别加入体积分数5%、10%、15%、20%、30%、40%的柴油，摇床37 ℃、200 r·min-1振荡培养，每12 h测定柴油降解率，每隔24 h测发酵液表面张力。

1.6.4 培养条件对复合菌株降解柴油的影响

向GM中接种复合菌株，分析以下环境因素对柴油降解的影响：(1)NaCl质量体积分数分别为0、5%、10%、15%、20%；(2)培养温度分别为20、28、37、45 ℃；(3)培养基初始pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。200 r·min-1混合培养48 h后加入体积分数5%的柴油，测其生长状况与柴油降解率。

1.7 扫描电镜观察

对在添加柴油和未添加柴油的GM中生长4 d的嗜盐菌进行扫描电子显微镜(SEM)观察，分析菌体降解柴油前后的形态变化。

2 结果与分析

2.1 柴油降解菌的筛选

通过体积分数3%柴油为唯一碳源的MSM筛选，共得到35株可以降解柴油的嗜盐菌。编号为B-1至B-35，其降解率在3.90%～54.00%(图1)。生物表面活性剂初筛结果见表1。筛选实验得到35株嗜盐菌，其中，B-2的排油圈直径可达6 cm(图2-A)，表面活性剂性质最为突出，在血平板上可产生较为明显的透明圈(图2-B)，其表面张力(27.15 mN·m-1)与对照(74.88 mN·m-1)相比，大幅度降低；同时，B-2的柴油降解率达到44.80%。B-18对柴油的降解率最高，达到54.00%，其表面活性剂性质也较为突出，溶血实验结果为阳性，表面张力降至28.14 mN·m-1。对比其他菌株的相关数据，判断嗜盐菌表面活性剂的产量与降解柴油能力之间存在高相关性。因此，选择B-2和B-18菌株进行下一步实验。

图1 三十五株嗜盐菌的柴油降解率Fig.1 Diesel degradation rates of 35 halophilic strains

表1 三十五株嗜盐菌表面活性剂初筛结果

续表1 Continued Table 1

图2 B-2菌株的排油圈(A)和溶血效果(B)Fig.2 Oil spreading (A) and hemolysis result (B) of B-2

2.2 菌株鉴定

B-2和B-18在GM平板上培养48～72 h后，如图3所示，B-2菌落为圆形，呈淡黄色，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明；革兰氏染色阴性，菌体细胞为杆状，(0.2～0.5)μm×(0.6～2.0)μm，单生或簇生。B-18菌落为橘红色圆形，菌落凸起，表面光滑较干燥，边缘整齐，不透明；革兰氏染色阳性，菌体细胞为球状，直径0.5～1.0 μm，单生或对生。

对B-2和B-18菌株的16S rRNA序列进行比对分析，选取同源性高的16S rRNA序列，利用MEGA 5软件对菌株及其近缘属种进行遗传距离分析，采用邻接法构建系统发育树，如图4所示。B-2与嗜盐盐渍微菌属(Salimicrobiumsp.)的几种细菌的模式菌株位于进化树的同一类群，经比较发现，B-2与菌株Salimicrobiumgeotgalistrain MJ3 (NR134168)的相似度为99%。B-18与盐水球菌属(Salinicoccussp.)的菌株Salinicoccussiamensisstrain PN1-2(NR_041459)的相似度为99%。结合细菌表型特征，将菌株B-2鉴定为嗜盐盐渍微菌属(Salimicrobiumsp.)，B-18为盐水球菌属(Salinicoccussp.)。

图4 菌株B-2(A)和B-18(B)的16S rRNA基因序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of B-2(A) and B-18 (B) based on 16S rRNA sequences

2.3 B-18对柴油降解的GC-MS分析

采用GC-MS法对柴油降解后的残留组分进行分析。在GC-MS分析中，未接菌的原始柴油中存在正构烷烃(C14-C29)和支链烷烃峰，而在接种了柴油降解菌降解后提取的柴油中，嗜盐菌可以降解柴油(C14-C29)中几乎所有的碳氢化合物，但是对短烷烃、长链烷烃和芳香烃的利用能力较差(图5)，这与已经报道的结果相一致[15]。因此，推测B-18适合于柴油和其他碳氢化合物污染的生物修复。

2.4 影响柴油降解的因素

2.4.1 柴油单一碳源

当B-2和B-18分别接种于以柴油为唯一碳源的MSM中时，柴油体积分数变化对B-2和B-18降解柴油效率的影响十分显著。如图6和图7所示，在未添加柴油的GM中菌体生长最旺盛，当MSM中柴油体积分数为5%时，嗜盐菌生长较旺盛，B-2对柴油降解率为35.62%，B-18对柴油降解率为45.62%。随着柴油浓度增加，降解率下降。分析认为适宜浓度的柴油为菌体生长提供碳源，菌体生长旺盛，促进了对柴油的降解，而柴油过多时对微生物具有一定的毒性，不利于微生物的生长[16]，从而使降解率下降。

图7 柴油体积分数对B-18在MSM中柴油降解率和生长曲线的影响Fig.7 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates and growth curve of B-18 in MSM

图6 柴油体积分数对B-2在MSM中柴油降解率和生长曲线的影响Fig.6 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates and growth curve of B-2 in MSM

A，B-2的菌落形态；B，B-2革兰氏染色；C，B-2扫描电镜下菌株形态；D，B-18的菌落形态；E，B-18革兰氏染色；F，B-18扫描电镜下菌株形态。A，Colony morphology of B-2; B，Gram staining of B-2; C，SEM photo of B-2; D，Colony morphology of B-18 ; E，Gram staining of B-18; F，SEM photo of B-18.图3 菌株B-2和B-18的形态特征Fig.3 Morphology characteristics of B-2 and B-18

A，降解前的柴油组分；B，B-18降解后的柴油组分。A，Diesel components before degradation; B，Diesel components after degradation by B-18.图5 柴油降解菌B-18降解前后的柴油GC-MS谱图Fig.5 GC-MS analysis of diesel components after degradation by B-18

2.4.2 单菌株培养柴油降解效果

由柴油单一碳源实验结果可知，在MSM中，高浓度柴油抑制B-2和B-18的生长，从而使其柴油降解率大幅度降低。因此，将嗜盐菌B-2和B-18分别在GM中培养至48 h，达到稳定期后，再加入不同浓度的柴油，继续振荡培养，测定柴油降解率，结果如图8所示。在GM中，将各菌培养至对数末期，此时菌体浓度最高、活性最强，然后加入柴油，嗜盐菌对柴油的降解能力显著提高。柴油体积分数为5%时，B-2的柴油降解率提高至49.08%，B-18的柴油降解率提高至53.46%。随着柴油浓度增加，柴油降解率逐渐下降。分析认为GM中微生物多使柴油降解率高，但是柴油体积分数过高使微生物降解酶活性受到抑制[17]，从而使降解率下降。因此，降解菌在营养丰富的GM中生长到一定浓度后再投加适宜量的的柴油，能有效提高菌株对柴油的降解率。

图8 柴油体积分数对B-2(A)和B-18(B)在GM中柴油降解率的影响Fig.8 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates of B-2 (A) and B-18 (B) in GM

2.4.3 复合菌株的柴油降解效果

同时接种B-2和B-18复合菌株，分析复合菌株对柴油的降解情况。由图9-A可知，同时接种B-2和B-18的培养基中，柴油降解率显著提高，柴油体积分数为5%时，柴油降解率高达68.50%，比单菌B-2提高了39.6%，比单菌B-18提高了28.1%；柴油体积分数为15%时，复合菌的降解率达40.57%；柴油体积分数为40%时，降解率仍达17.22%。现有文献未见柴油浓度为40%时仍有降解能力的菌株[18]。研究表明，柴油的憎水性能阻碍微生物与其接触并进行降解，而某些微生物可在柴油的诱导下产生生物表面活性剂，促进柴油进入细胞内使其被降解[19-20]。如图9-B所示，未添加柴油的GM发酵液表面张力没有明显变化，而添加柴油后，随着发酵时间的增加发酵液表面张力逐渐降低，且在降解第2天，表面张力骤减，说明菌株在有柴油的培养基内产生了表面活性剂，降低了发酵液表面张力，促进了菌体对柴油的摄取和降解。另有研究表明[21]，复合菌株对柴油的降解效果显著优于单菌株。

图9 柴油体积分数对复合菌株在GM中柴油降解率和发酵液表面张力的影响Fig.9 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates and surface tension of fermentation broth of the microbial consortium in GM

以上分析说明，当高产生物表面活性剂菌B-2与高效柴油降解菌B-18混合培养降解柴油时，柴油诱导嗜盐菌产生了生物表面活性剂，其具有良好的乳化和增溶性能，降低液体表面张力，因此，可以大大提高柴油的分散度，从而使得柴油与细胞充分接触，加快柴油进入菌体细胞并被降解，因此，柴油降解能力显著提高。

2.4.4 培养条件对复合菌株柴油降解率的影响

如图10-A所示，NaCl质量体积分数为10%是复合菌株降解柴油的最适盐浓度，降解率为68.50%，过低或过高的盐浓度都不同程度地抑制菌体的生长，NaCl质量体积分数为5%和15%时的降解率仍为47.65%和30.21%，可见复合菌株具备一定的耐盐能力。培养温度对复合菌株柴油降解率影响较明显(图10-B)，当温度为12 ℃时，发酵液较澄清，柴油降解率较低，仅为6.40%，随着温度的升高，菌株生长旺盛，柴油降解能力逐渐提升，28 ℃时柴油降解率为47.85%，37 ℃时菌株的生长量达到最大，并且柴油降解率达到最高(68.50%)；温度继续升高，菌体生长量与降解率都呈下降趋势，因为微生物主要通过细胞内的降解酶系对柴油进行降解，温度过高或过低，都会抑制微生物的代谢活动。复合菌株最适的生长pH在7.5左右(图10-C)，此时对柴油的降解率也最大，达到70.45%；pH为8.0时，对柴油的降解率低于7.0而高于6.5，这可能是因为当pH在7.0～8.0的弱碱性环境下，微生物代谢较为旺盛，从而加快对柴油的降解[22]。

A，NaCl对柴油降解率的影响；B，温度对柴油降解率的影响；C，pH对柴油降解率的影响。A，Effect of NaCl concentration on diesel degradation rates; B，Effect of temperature on diesel degradation rates; C，Effect of pH value on diesel degradation rates.图10 培养条件对复合菌株柴油降解率的影响Fig.10 Effect of culture conditions on diesel degradation rates of the microbial consortium in GM

2.5 降解柴油的SEM分析

对在含柴油培养基中生长4 d的嗜盐菌进行扫描电镜观察，B-2菌体形态由杆状变成弧状，并且菌体细胞变大而显得更加饱满(图11-A)，在未添加柴油培养基中生长的嗜盐菌与之相比，菌体要小(图3-C)；B-18细胞表面形成黏性聚合物，将单个细胞连接成复杂的凝聚体，并且连接紧密以致形成膜内陷(图11-B)，在体积分数40%柴油培养基中生长的B-18细胞表面的复合物分布更密集(图11-C)，可能柴油促进这种复合物的形成，而在未添加柴油的培养基中生长的菌体相对分散，相对连接不紧密(图3-F)。有研究表明，扫描电镜观察到的胞外聚合物可能是柴油和生物表面活性剂的复合物，这种复合物可以加速细胞对柴油的摄取，从而提高柴油降解率[23]。

3 讨论

已有报道表明，常见的具有柴油降解性能的微生物主要是细菌类和真菌类[24]，大多是从被柴油污染的土壤或海水中获得，关于从盐场筛选得到的嗜盐菌降解柴油的研究较少。本研究从盐场分离得到的嗜盐菌中筛选出1株高产生物表面活性剂嗜盐菌B-2和1株高效柴油降解嗜盐菌B-18。B-2可将培养液表面张力从74.88 mN·m-1降至27.15 mN·m-1。Souza等[25]筛选得到一株产生物表面活性剂的酵母菌，可以将发酵液表面张力降至30 mN·m-1，并且该菌不能耐盐碱，而B-2能适应高盐环境，推测其应用领域更为广泛。柴油体积分数为3%时，B-2对柴油的降解率为44.80%，B-18对柴油的降解率为54.00%，与已报道菌株的降解率相比[26-27]，其降解能力处于中间水平。本研究筛选到的菌株分别属于嗜盐盐渍微菌属(Salimicrobiumsp.)和盐水球菌属(Salinicoccussp.)，本文首次报道了盐水球菌属的柴油降解作用。另有研究表明，一些微生物能够通过产生生物表面活性剂，提高对柴油的摄取进而加快降解，且细菌产生表面活性剂的多少与降解柴油的能力呈正相关[28]，如菌株Pseudomonassp. BP10通过产生生物表面活性剂降低了发酵液的表面张力，促进了柴油的乳化作用，但本研究的结果却不同，虽然B-18生物表面活性剂的活性不如B-2强，但柴油降解能力强，这可能是因为B-18其他代谢产物对其有影响。GC-MS结果显示，B-18可以降解柴油中几乎所有的碳氢化合物，但是对短烷烃、长链烷烃和芳香烃的利用能力较差，这与已经报道的结果相一致[15]。

混合接种B-2和B-18于GM中，复合菌对柴油的降解效果最好，柴油体积分数为5%时，对柴油的降解率提高至68.50%，降解率比单菌B-2提高了39.6%，比B-18提高了28.1%，高于张海玲等[29]的报道，柴油体积分数为2%时，其构建的柴油降解复合菌的降解率为61.3%，当柴油体积分数为40%时，降解率仍为17.22%。当柴油体积分数为5%时，吴秉奇等[21]研究的复合菌系SQ1的降解率显著下降。本研究中2株菌混合接种出现明显的协同效应，发酵液表面张力显著降低，B-2高产生物表面活性剂，提高了复合菌系对柴油的摄取利用[30]。

A，在含有5%柴油的培养基中生长的B-2菌株细胞形态；B，在含有5%柴油的培养基中生长的B-18菌株细胞形态；C，在含有40%柴油的培养基中生长的B-18菌株细胞形态。A，Scanning electron microscopy (SEM) of B-2 grown on 5% diesel; B，SEM of B-18 grown on 5% diesel; C，SEM of B-18 grown on 40% diesel.图11 B-2和B-18的扫描电镜图像Fig.11 Scanning electron microscopy photograph of B-2 and B-18

本研究发现，反应体系的盐浓度、温度和pH对复合菌系降解柴油的影响较为显著，盐浓度直接影响菌体的生长状态，适宜的盐浓度下菌株才能生长旺盛，温度影响菌株的代谢活动，pH可能与菌体细胞内降解柴油的酶系活力相关[31]。总体来看，复合菌系对盐浓度、温度和pH都具有较宽范围的耐受能力，这与嗜盐菌独特的理化性质和结构有关[32]。单因素实验结果表明，柴油体积分数为5%时，复合菌株的最佳盐浓度为10%，最佳温度为37 ℃，最佳pH为7.5，在该条件下对柴油降解率达到最大(70.45%)。复合接种不仅能适应高盐的含油环境，而且能够产生生物表面活性剂，对处理柴油污染并伴随高盐情况的生物修复具有重要的意义。

本研究筛选到的柴油降解菌是来自盐场的嗜盐菌，对环境的适应能力优于普通菌株，目前有关嗜盐菌的研究主要集中在菌株的多相分类和功能酶作用研究等方面，本研究是首次对盐水球菌属降解柴油作用进行报道，对于混合接种B-2和B-18时柴油的降解代谢机理，如烃代谢途径、烃降解酶系等有待进一步研究。另外，柴油降解菌一般应用于被柴油污染的土壤或者海水区域，现场环境复杂，还需进行现场实验来验证复合菌系对柴油的降解效果。