BDNF过表达的人脐带间充质干细胞源性多巴胺能样神经元的构建和鉴定

蒋芝 徐君 冯美江

PD是一种与年龄相关的神经退行性疾病，以运动迟缓、静止性震颤、姿势平衡障碍和肌强直等症状为主要临床表现。PD的具体病因及发病机制尚未明确，目前的治疗方式只能改善临床症状，并不能逆转PD的病情进展。近年来，干细胞移植治疗PD引起了人们的关注。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymalstemcell，HUC-MSCs）来源于新生儿的脐带组织，具有来源广泛、免疫源性低、取材无创性、无伦理问题、不受供体年龄因素影响等优势，成为干细胞移植治疗PD的理想种子细胞［1］。研究证明，HUC-MSCs能被诱导分化为多巴胺能样神经元，移植治疗PD大鼠模型后能改善其行为学症状［2-3］。脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）是神经营养因子家族中的一员，可促进干细胞向神经元的分化、成熟［4］，并提高移植的细胞在PD模型动物脑内的存活能力［5］。据一项meta分析显示，PD病人血清中BDNF水平是降低的［6］。BDNF过表达载体的构建，除了可补充PD病人BDNF的不足外，同时可提高移植细胞的存活率，可能是细胞移植治疗PD不可或缺的部分。本研究旨在体外构建并鉴定BDNF过表达的HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元。

1 材料与方法

1.1 材料 荧光二抗（塞尔维生物公司），抗-NeuN抗体、抗-Nurr1抗体和抗-β-tubulinⅢ抗体（北京博奥森），抗-酪氨酸羟化酶（TH）抗体（购自 Abcam），DAPI（南京贝斯特公司），pEGFP-N1-GFP-BDNF慢病毒载体（汉恒生物科技有限公司），碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、成纤维生长因子 8（fibroblast growth factor 8，FGF8）、N2 因子（武汉艾美捷科技有限公司），胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、DMEM/F12基础培养基（美国GIBCO公司），Lipofectamine 2000（上海嵘葳达实业有限公司），维生素C（Vit-c）、音猬因子（Sonic Hedgehog，SHH）、BDNF siRNA（5'-GCGCCCATGAAAGAAGTAA-3'，汉恒生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUC-MSCs的分离与培养：本实验遵循伦理学标准和国家相关规范。在无菌条件下收集健康足月剖宫产新生儿脐带组织（来自南京医科大学附属妇产医院），用生理盐水冲洗后去除脐动、静脉，分离出华通氏胶并将其剪成约 1 mm的3块小组织，接种于DMEM/F12完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞长至90%融合度时进行传代。按照1：3传代培养，取P3代细胞用于实验。

1.2.2 HUC-MSCs的诱导分化：将P3代以1×104个/孔密度接种于24孔细胞培养板，培养24 h后更换神经诱导液［DMEM/F12、50μg/mLVit-c、250ng/mLSHH、100 ng/mL FGF8、50 ng/mL bFGF、N2因子（100×）］。诱导9 d后，向诱导液中加入50 ng/mL BDNF（加入BDNF时，24孔板不更换诱导液），继续诱导3 d。每天观察、拍照，将未诱导的HUC-MSCs作为对照。

1.2.3 免疫荧光鉴定：未分化的HUC-MSCs和HUCMSCs源性的多巴胺能神经元细胞分别以2×105/孔接种于6孔板中，培养24 h后进行免疫荧光检测。用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS冲洗3次，每次5 min。5%小牛血清蛋白（BSA）常温封闭20 min后，分别将兔抗 NeuN（稀释浓度为 1：500）、兔抗 β-tubulinⅢ（1：1000）的一抗加入相应孔中，4℃孵育过夜；加入相应的荧光二抗（1：100）避光孵育1 h后，PBS冲洗3次，每次5 min；加入DAPI（1：1000）避光染色10 min；50%甘油封片。荧光显微镜下拍照，采用Image J软件对荧光图片进行半定量分析。阳性表达率=阳性细胞/DAPI。

1.2.4 慢病毒介导的pEGFP-N1-GFP-BDNF的转染与鉴定：将细胞分为HUC-MSCs组、多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF载体组和多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组。将HUC-MSCs源性的多巴胺能样神经元细胞接种于6孔板中，培养18～24h后，用含有6μg/mL polybrene的2 mL新鲜培养基替换原培养基，并加入30 μL的含有pEGFP-N1-GFP-BDNF的病毒悬液。37℃孵育4 h后，加入2 mL新鲜培养基稀释polybrene，继续培养24 h，用新鲜培养基替换含有病毒颗粒的培养基继续培养，转染48 h后，通过检测绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达，证实慢病毒载体将GFPBDNF转染到HUC-MSCs源性的多巴胺能样神经元中。应用免疫荧光检测转染后各组细胞Nurr1和TH的共表达情况，检测方法同前，其中行荧光双标时将一抗混合液加入各组中孵育过夜，主要一抗：鼠抗Nurr1（1：1000）和兔抗 TH 的一抗（1：1000）。

1.2.5 BDNF siRNA转染：HUC-MSCs源性的多巴胺能样神经元细胞接种于6孔板中，待培养至70%左右融合度后，用最低必需培养基改良型减血清培养基（Opti-MEMⅠ）稀释的Lipofectamine 2000与BDNF siRNA分别在室温下孵育5 min，轻轻混匀，再继续孵育20 min，然后小心加入待转染的细胞中。细胞在37℃、5%CO2培养箱孵育72h后，在荧光显微镜下拍照观察。

1.3 统计学分析 所有数据采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 5软件进行统计处理，以均数±标准差（±s）表示。2组间比较采用 t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。每组数据来自至少3次重复实验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分离培养及诱导后HUC-MSCs的形态学变化根据上述方法从脐带组织中分离出HUC-MSCs，培养至P3代，可见细胞大小及形态较为一致，呈梭形细胞；诱导后细胞呈神经元样形态（图1）。

图1 诱导前后细胞形态学变化（×100）

2.2 HUC-MSCs诱导分化后NeuN和 β-tubulinⅢ的表达与Nurr1和TH的共表达 免疫荧光检测结果显示，HUC-MSCs诱导分化后，神经元特异性标记物NeuN阳性表达率为（53.88±1.31）%，较诱导前明显增高（P＜ 0.01）；β-tubulin-Ⅲ阳性表达率为（89.22±0.94）%，也较诱导前明显增高（P＜0.001）（图2）；且多巴胺能神经元标记物Nurr1和TH的共表达也显著增加（P＜0.001）（图 3）。

图2 免疫荧光检测诱导前后细胞中NeuN、β-tubulinⅢ的表达

图3 免疫荧光检测诱导前后细胞中Nurr1和TH的共表达

2.3 转染后各组细胞中GFP表达 荧光显微镜观察结果表明，多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF载体组细胞中可见明显的GFP表达；而HUC-MSCs组、多巴胺能样神经元组和多巴胺能样神经元+BDNFsiRNA组细胞皆未见明显绿色荧光（图4）。

图4 荧光检测各组细胞中GFP的表达（×200）

2.4 转染后各组细胞中Nurr1和TH的共表达 免疫荧光检测发现，与HUC-MSCs组相比，多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF载体组的Nurr1和TH的共表达显著增高（P＜0.001），多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组也明显增多（P＜0.01）。多巴胺能样神经元组和多巴胺能样神经元+空载体组之间Nurr1和TH的共表达无明显差异（P＞0.05）。而多巴胺能样神经元+BDNF组Nurr1和TH的共表达较多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组明显增多（P＜0.01）。多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组Nurr1和TH的共表达较多巴胺能样神经元组和多巴胺能样神经元+空载体组明显减少（P＜0.01），较多巴胺能样神经元+BDNF组也明显降低（P＜0.001）（图5）。

3 讨论

图5 免疫荧光检测各组细胞Nurr1和TH共表达

研究证明，抑制BDNF的表达可导致大量多巴胺能神经元丢失［7］。因此，BDNF对神经元的发育、分化、存活和增殖起着重要的促进作用，并可以促进干细胞向神经元的分化与成熟，促进移植的多巴胺能样神经元存活以及多巴胺的释放［8-9］。已有研究表明，BDNF对神经系统退行性疾病如PD、AD等均可发挥有效的治疗作用［10-11］。

本研究在体外诱导分化HUC-MSCs，发现其不仅形态上趋向于神经元，且神经元特异性标记物NeuN和β-tubulinⅢ表达明显增加，过表达BDNF的细胞中，特异性多巴胺能神经元标记物Nurr1和TH的共表达明显增高，证实BDNF可以促进HUC-MSCs在体外向多巴胺能样神经元细胞分化，且分化后的细胞明显增加。这可能是由于BDNF可通过MAPK/ERK和PI3K/Akt依赖的信号通路来刺激HUC-MSCs向神经分化，并促进分化后细胞的存活［12］，这也与以往的研究一致［13］。Nurr1是一种特异性表达于中脑多巴胺能神经元的转录因子，通过调节对氧化应激的抗性，起到对多巴胺能神经元保护的作用［12］。TH是多巴胺生物合成过程中的限速酶，被认为是多巴胺能神经元的特异性标记物。转染后检测发现，过表达BDNF的HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元组中Nurr1和TH的共表达较HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元组进一步增加，BDNF siRNA干扰后细胞中的Nurr1和TH的共表达显著减少。我们的结果又进一步证明BDNF可促进多巴胺能样神经元的分化与成熟。Chen等［15］发现，BDNF通过与高亲和力受体TrkB结合，启动PI3K/Akt/mTOR信号通路，进一步抑制细胞凋亡、促进增殖，对神经细胞起保护作用。而BDNF促进HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元的转化与成熟是否与PI3K/Akt信号通路有关尚待进一步研究。

总之，我们的研究结果表明，HUC-MSCs在体外可成功向多巴胺能样神经元诱导分化，慢病毒介导的BDNF转染HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元能促进干细胞的分化和多巴胺能样神经元的存活和成熟。我们推测BDNF过表达的HUC-MSCs源性多巴胺能样神经元的构建用于治疗PD的疗效可能优于单纯的干细胞移植，但结果如何仍需在今后的体内试验中进一步观察与验证。