百脉根中Lj5NG4与结瘤因子受体LjNFR1互作调控根瘤菌侵染

宋嘉宾　端木德强

摘要：以百脉根结瘤因子受体激酶LjNFR1为诱饵，通过建立百脉根根瘤共生不同时期的酵母膜双杂文库筛选获得了一个与之互作的生长素相关转运蛋白Lj5NG4。通过酵母双杂交和烟草Split-Luc等试验进一步证实了Lj5NG4与LjNFR1的蛋白互作。利用CRISPR-Cas9基因敲除及超表达技术创建相关转基因材料，研究发现Lj5NG4可能在根瘤菌侵染前期起负调控作用，但对结瘤过程没有显著影响。同时启动子表达也证实了Lj5NG4在侵染前期根毛中强烈表达，成熟根瘤内部不表达。外源施加生长素试验发现低浓度的生长素会减弱Lj5NG4突变体的早期侵染表型，这表明生长素在共生结瘤发育中通过Lj5NG4发挥功能。

关键词：百脉根;根瘤菌侵染;LjNFR1;Lj5NG4;生长素

中图分类号：Q789         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）05-0145-07

Abstracts： Using the Lotus japonicus nodule factor receptor kinase LjNFR1 as a bait and a yeast membrane two hybrid library constructed with transcripts harvested at different stages of nodule symbiosis， we identified an auxin related transporter protein Lj5NG4. The interaction between Lj5NG4 and LjNFR1 was further confirmed by yeast two hybrid and Split-Luc experiments. Using CRISPR-Cas9 and overexpression technology， we conclude that Lj5NG4 may play a negative regulatory role in the early stage of rhizobial infection， but had no significant effect on nodule formation. Meanwhile， promoter expression also confirmed that Lj5NG4 was strongly expressed in root hairs at the early stage of infection， but not in inner mature nodules. Exogenously applied auxin treatment showed that low concentration of auxin weakened the phenotype of Lj5NG4 mutant， indicating that auxin plays a role in the development of symbiotic nodules.

Key words： Lotus japonicus; rhizobium infection; LjNFR1; Lj5NG4; auxin

豆科植物特異性地与根瘤菌共生导致在植物根部形成新的器官，称为根瘤。根瘤细胞内分化的根瘤菌可以将空气中的N2固定并转化为氨交换宿主植物的碳水化合物。根瘤菌感知豆科植物产生的黄酮类化合物时分泌结瘤因子（Nodulation factor，NF）被视为共生信号传导过程起始。而百脉根结瘤因子受体NFR1[1]和NFR5[1，2]以及蒺藜苜蓿中相应的蛋白LYK3[3，4]和NFP[5]是感知结瘤因子的重要节点。最终根瘤菌通过侵染线（Infection threads，ITs）进入根部，并在植物体内定植，发育形成根瘤[6]。功能性结瘤的形成需要两个独立但紧密协调的发育过程：细菌侵染和结瘤器官发生。

LjNFR1和LjNFR5都属于LysM受体样激酶，由三个典型的结构域组成，分别为胞外的LysM结构域，一个跨膜结构域（TM）和膜内丝氨酸、苏氨酸激酶结构域。结瘤因子的主要结构为脂质几丁质寡糖，能够被LysM识别。Radutoiu等[1]在百脉根中鉴定到nfr1和nfr5两种突变体，在接种根瘤菌的条件下均不能响应结瘤因子信号，侵染及结瘤发生严重受阻。Madsen等[7]研究表明，NFR1和NFR5可以形成受体复合物，并且NFR1磷酸化NFR5，从而使胞外的LysM结构域与结瘤因子相结合，导致复合体的结构变化，从而与下游蛋白质进行结合，向下游传递共生信号。但目前其信号传递机制仍没有得到完全阐明，因此，鉴定与LjNFR1互作的蛋白质并揭示其共生信号调控网络十分重要。

有学者利用传统的酵母双杂交技术将NFR1的膜内蛋白激酶结构域作为诱饵，分别鉴定到NFR1的互作蛋白PUB1[8]、SYMREM[9]。但更多的可能与NFR1等受体激酶的互作对象来源于膜蛋白质，这为LjNFR1互作蛋白质的筛选造成了明显障碍。通过建立酵母泛素膜双杂交系统，以百脉根共生受体激酶LjNFR1全长作为诱饵蛋白质进行筛选，得到一个生长素转运相关的5NG4-like蛋白质。本研究利用酵母以及烟草体内异源系统验证了百脉根Lj5NG4蛋白质与LjNFR1蛋白质的互作，借助tYFP荧光蛋白质信号的共聚焦显微镜观察证实了5NG4在侵染前期根毛中强烈表达，而在后期根瘤内部不表达。利用CRISPR-Cas9技术得到百脉根Lj5NG4基因敲除的纯合稳定突变体，研究其共生表型发现Lj5NG4更多的在侵染前期尤其是侵染线形成过程中发挥抑制作用，但对结瘤数没有显著影响。此外，鉴于Lj5NG4可能是生长素转运子，对Lj5NG4突变株进行生长素的体外施加试验，经过生长素处理后，突变株侵染线数目上升的表型被显著减弱，而不受突变影响的结瘤表型受生长素调控明显增加，这表明生长素正调控共生侵染和根瘤发育。本研究初步分析了Lj5NG4在百脉根中的共生表型，为共生信号网络的完善提供了新的思路。

1  材料与方法

1.1  材料与主要试剂

百脉根MG20野生型种子和烟草种子由实验室保存提供。根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens EHA105、GV3101，发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes LBA1334，根瘤菌Rhizobium MAFF303099、NZP2235，酵母菌株THY.AP4[MATa ura3leu2lexA：：lacZ：：trp1lexA：：HIS3lexA：：ADE2]由实验室保存并提供。

1.2  质粒构建

以百脉根根与根瘤RNA的反转录产物作为模版，设计引物5NG4-F和5NG4-R，使用高保真酶Q5扩增全长5NG4的开放阅读框序列。PCR程序为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环35次;72 ℃延伸10 min。按常规方法克隆到pPR3-N-G、JW772载体上。所有构建的载体均通过测序验证。

使用同上的模版，设计引物NFR1-F和NFR1-R，使用KOD扩增全长NFR1的开放阅读框序列。PCR程序为：95 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s，51 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，循环5次;98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，循环30次;68 ℃延伸10 min。按常规方法克隆到pBT3-SUC、JW771载体上。

以百脉根总基因组DNA为模版，在第一个密码子ATG上游2.2 Kb扩增启动子序列，设计引物5NG4pro-F、5NG4pro-R，PCR程序为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，循环35次;72 ℃延伸10 min。按常规方法克隆到pC1300-tYFP-NLS载体上。

1.3  酵母试验检测蛋白质-蛋白质互作

将质粒pPR3-N-5NG4与pBT3-SUC-NFR1通过醋酸锂法共转化酵母菌株AP4，共转菌株涂布于SD/-Trp-Leu平板上，30 ℃培养2～3 d。同时以pAI-Alg5、pCCW-Alg5共转酵母作为正对照，pDL2-Alg5、pBT3-SUC-NFR1共转酵母作为负对照，pAI-Alg5、pBT3-SUC-NFR1共转酵母验证蛋白质表达。挑选单克隆在SD/-Trp-Leu培养基中活化培养，调节OD600保持一致，稀释成5个浓度梯度，于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade+15 mmol/L 3-AT的选择性培养基上进行点菌，30 ℃培养3 d后观察。

1.4  烟草叶片体内验证蛋白质互作

将质粒JW772-5NG4与JW771-NFR1通过电转化共转农杆菌菌株GV3101，LB（Kan+，Rif+）平板置于30 ℃培养2 d。同时将JW771和JW772共转农杆菌作为负对照，JW771-LPOR和JW772-PCYA共转作为正对照，分别将空载与JW772-5NG4、JW771-NFR1共转作为自激活验证。注射烟草叶片进行瞬时表达，黑暗处理48 h后涂抹底物，通过活体成像仪CCD收集记录荧光信号。

1.5  农杆菌介导的百脉根植物转化

百脉根毛根转化和稳定转化方法主要参考Lotus japonicus操作手册。毛根转化将萌发5 d的幼苗从下胚轴剪短，将携带目的质粒的农杆菌LBA1334菌液侵染伤口约40 min，转移至MS培养基中，暗培养2～3 d转光照培养2～3 d，然后移至HRE生根培养基，约2周后在体式荧光显微镜下鉴定阳性根，剪去无荧光的非阳性根，种植到蛭石珍珠岩混合基质中，用于后续试验。

稳定转化将萌发幼苗的茎剪成0.3～0.5 cm的小段，与根癌农杆菌EHA105共培养暗处理7 d，转入含有抗生素潮霉素的愈伤筛选培养基继代培养约5周，再转入芽诱导、芽伸长培养基使茎伸长，最后将芽切下移至生根培养基，直至根长出，得到稳定转化的T0代植株。

1.6  外源施加生长素处理

使用无氮营养液配置浓度分别为10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L的NAA溶液，将萌发5 d的幼苗種植到蛭石珍珠岩混合基质中，隔天浇灌定量的生长素溶液，7 d后接种根瘤菌NZP2235-hemA：：LacZ，继续浇灌含生长素的无氮营养液，进行前期和后期共生表型统计。

2  结果与分析

2.1  Lj5NG4蛋白质生物信息学分析

以LjNFR1为诱饵筛选百脉根酵母膜双杂文库，得到auxin-induced 5NG4-like蛋白质编码基因（Lj0g3v0198499）。通过Blast进行同源序列比对发现，与含有10个跨膜结构域和2个DUF6功能结构域的同家族蛋白质相比，筛选得到的多个5NG4-like蛋白质编码序列只含有最多4个C端跨膜域和1个不完整的DUF6结构域。根据华中农业大学微生物学国家重点实验室曹扬荣老师课题组提供的百脉根基因组数据库，最终得到全长的基因和蛋白质序列。对不同物种中5NG4进行系统发育树分析，发现Lj5NG4属于nodulin MtN21/EamA-like transporter蛋白家族（图1a）。对全长蛋白质进行跨膜域分析，确定存在10个跨膜域，N端在膜内，与同源蛋白质一致（图1b）。

2.2  百脉根LjNFR1与Lj5NG4蛋白质互作的异源体内验证

利用酵母双杂交技术，进一步确定LjNFR1和Lj5NG4蛋白质相互作用的存在。将试验组和对照组转入酵母菌株THY.AP4，产生的阳性克隆分别在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade+15 mmol/L 3-AT平板上点菌。根据图2a的结果，Lj5NG4蛋白质在酵母中能够与LjNFR1蛋白产生强烈的相互作用。

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