益肾喘宁汤干预肾气虚哮喘大鼠Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片分析

黄学仄 姜春燕 黄志盛 郑小伟#

1 苍南县中医院 浙江 苍南 325800

2 浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

3 慈溪市中西医结合医疗健康集团慈溪市红十字医院 浙江 慈溪 315300

慢性哮喘是一种非传染性的炎症性气道疾病，其特点是可逆的高反应性和进行性气道炎症。肾气虚型哮喘是支气管哮喘常见的分型之一，中药益肾喘宁汤在肾气虚哮喘治疗中具有疗效确切、副作用小、安全可靠等优势。Jak-STAT信号途径可参与细胞的增殖、分化及凋亡等过程[1-2]，与哮喘发病机制之间存在着特别密切而复杂的关系。本研究采用Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片技术全方位检测肾气虚哮喘大鼠以及益肾喘宁汤干预后Jak-STAT信号通路的蛋白磷酸化水平变化，筛选出磷酸化调变位点，为后续的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级雄性Wistar大鼠30只，鼠龄6～8w，重量220～250g。自上海斯莱克实验动物有限责任公司购买，依照《中华人民共和国实验动物管理条例》相关条例饲养在浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 主要试剂与药物：OVA卵清蛋白（OVA，gradeV，sigma有限公司，批号：SLBQ9036V）；Al(OH)3粉末（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20130818）；益肾喘宁汤由熟地黄、淮山药、山茱萸、泽泻、丹皮、茯苓、苦参、天浆壳各12g，旋覆花、黛蛤散、生黄芪各15g，北五味子5g，沉香8g组成，中药饮片均从浙江中医药大学中医门诊部购买，用自动煎药机制备成含生药量1.6g/ml的药液，存放于4℃冰箱，备用。

1.3 主要仪器和软件：芯片扫描仪（Axon Instruments，USA）；酶标仪（PE Victor，PE，USA）；芯片小型离心机（ChipMate PMC-082，Tomy，Japan）；Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片（Full moon，美国）；软件GenePix Pro 6.0（Axon Instruments，USA）。

1.4 方法：适应性喂养7天后，将大鼠随机分为正常对照组、肾气虚哮喘模型组、中药组，10只/组。根据课题组前期实验造模方法[3]，除正常对照，其余大鼠均采用OVA致敏法进行哮喘造模，在“恐伤肾”“恐则气下”“劳则气耗”等中医学理论指导下采取游泳力竭法、梅花针刺激、悬吊应激等方法进行肾气虚证型造模，共持续2周。实验第15天开始，中药组大鼠均予益肾喘宁汤灌胃，日给药剂量参照《医学实验动物学》计算大鼠的等效剂量。实验第29天，用戊巴比妥钠麻醉大鼠后进行腹腔取血，解剖后分离肺脏并取出，切取部分肺组织存放于10%中性福尔马林溶液中，用于病理检测；另一部分用生理盐水冲洗干净，切取直径4～5mm大小的肺组织置于冻存管内，随后投入液氮中，最后将所收集样本转移至-80℃冰箱。

1.5 模型验证：观察并记录各组大鼠造模、给药前后一般情况的改变，包括饮食量、活动量、呼吸情况、毛发顺泽度等；肺组织的常规HE染色、病理切片用于显微镜下观察分析。

1.6 信号通路磷酸化抗体芯片技术：Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片分析：①Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片检测：按照Full Moon公司标准操作流程进行样品蛋白抽提、标记，芯片封闭和芯片杂交后，GenePix 4000B扫描芯片。②数据分析：对扫描获取的芯片图像，GenePixTMPro v6.0软件读取原始数据，对芯片背景、阳参及内参位点的信号强度情况进行统计，计算每个蛋白位点的荧光信号的均值、标准差、标准误。组内每种抗体的磷酸化水平=该种抗体磷酸化位点的信号值均值/对应非磷酸化位点的信号值均值。将组间调变差异磷酸化位点蛋白数控制在总检测蛋白数的10%～30%的条件下设置实验组/对照组的组间比值FC≥1.3或≤1/1.3获得的磷酸化位点蛋白。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察：整个造模期间，正常组大鼠无特殊变化，毛发顺泽，呼吸平稳，行动如常，纳食二便无异常变化；造模后肾气虚哮喘模型组大鼠呼吸频率加快、口唇发紫，在每日雾化激发后尤为显著，体质量增长幅度不如正常组大鼠，毛发比正常组粗糙色黯，伴时常躁动不安、蜷卧扎堆、抓耳挠腮、大小便失禁等症状；中药组上述情况较肾气虚哮喘组均有明显改善。

2.2 肺组织HE染色结果：正常组样本的肺泡、支气管结构均清晰完好；肾气虚哮喘模型组大鼠肺组织切片可观察到炎性细胞（包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞）浸润、支气管上皮脱落和平滑肌增厚的病理变化；中药组大鼠的肺组织切片可观察到上述现象均有所改善。

2.3 芯片检测结果：从每组大鼠中，随机抽取一个肺组织样本，采用信号通路磷酸化抗体芯片技术检测大鼠肺组织Jak-STAT通路相关蛋白磷酸化水平变化。结果详见表1。

表1 Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片调变位点

3 讨论

课题组前期实验已证实肾气虚哮喘模型中存在T细胞分化过程，以及相关炎症因子分泌异常，益肾喘宁汤正是通过影响该过程以及促进抑炎因子分泌起效，这与现代医学治疗哮喘的原理基本一致，但其治疗哮喘的具体作用机制尚未明确。本研究所采用的益肾喘宁汤为笔者临床验方，本方以七味都气丸为基础，加入生黄芪增强益气，苦参、天浆壳、旋覆花、黛蛤散、沉香调节升降失常之气机。诸药合用，共同发挥平喘益肾、清肺止咳的功效。

本实验采用Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片检测和分析，发现肾气虚哮喘大鼠相比于正常组大鼠，存在8个调变磷酸化位点。其中，与正常组相比，肾气虚哮喘模型组大鼠有3个位点上调（STAT5B、JAK1、JAK2蛋白），5个位点下调（STAT5A、STAT1、STAT3、PTPN11、IL10RA蛋白），经过益肾喘宁汤干预后的大鼠有2个位点（STAT5A、PTPN11蛋白）上调。

STAT5A和STAT5B是高度同源的蛋白质，在免疫功能中发挥独特作用[4]。Burnham等[5]发现变应性哮喘时嗜酸性粒细胞STAT5下调的证据。肾气虚哮喘模型组STAT5A下调，经中药干预后上调，提示益肾喘宁汤可能通过上调STAT5A来调控Th2和Th17的分化发挥作用。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(PTPN11)是一种广泛表达的细胞内酶，具有通过作用于AKT下游并抑制mTOR活性形式来控制细胞因子/生长因子途径的能力。本实验中肾气虚哮喘大鼠PTPN11下调，益肾喘宁汤干预后PTPN11上调，提示益肾喘宁汤可能通过调节SHP2蛋白改善大鼠炎症反应。

综上，益肾喘宁汤有效抑制肾气虚哮喘大鼠炎症反应，可能是通过Jak-STAT信号通路来调节T淋巴细胞亚群比例，改善机体免疫功能的。