褪黑素采前喷施对采后番茄果实抗病性和贮藏品质的影响

生吉萍，赵瑞瑞，陈玲玲，申 琳,*

（1.中国人民大学农业与农村发展学院，北京 100872;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

果蔬是重要的经济作物，同时也是重要的食物来源，其在生长发育、采后贮藏保鲜过程中容易受到病原微生物侵染。据统计，病原菌每年大约造成全球农作物产量损失15%[1]，同时也会产生食品安全问题。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是最常见的真菌病原菌之一，寄主范围非常广泛，能够感染200余种作物，对作物的花、叶、果实等部位造成侵染性病害，严重危害着果蔬的生长发育过程和采后贮藏保鲜。

番茄是世界上重要的经济作物之一，在生长发育和采后贮藏中容易受到灰葡萄孢菌侵染，目前，防治番茄病害最普遍有效的方法是化学杀菌，但化学杀菌剂的频繁使用不仅使果蔬产生耐药菌，也使得农药残留量逐渐增加，严重危害人类健康和生态环境[2]。随着人民生活品质的提高，食品安全和环境污染问题日益受到关注，开发更加安全、环保的病害防控方法成为当务之急。

褪黑素的化学名称是N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，因其在动物中是由大脑的“松果体腺”分泌的一种激素，又被叫作松果体素。褪黑素广泛存在于生物体中，是动植物、微生物进化过程中一种保守的分子。1995年，人们首次在植物中检测到褪黑素[3]。随后的研究发现，褪黑素普遍存在于高等植物的根、茎、叶、花、果实和种子中，其含量很低，通常每克组织样品含褪黑素的质量数量级为pg～ng[4-6]。研究表明，褪黑素不仅在植物根、茎等器官的发育过程中发挥作用，还在植物顶端优势、开花、衰老等过程中发挥重要作用。在生物和非生物胁迫方面，褪黑素在植物清除活性氧自由基，抗盐、高温、干旱、紫外线、重金属和化学药剂等逆境胁迫中起着重要的作用，除此以外，褪黑素还能提高苹果树抗褐斑病、拟南芥抗PstDC3000病原菌侵染的能力;但褪黑素在采前果实中应用与机理研究还鲜见报道。

本研究以褪黑素采前喷施番茄植株，研究其对采后果实抗灰葡萄孢菌能力和品质的影响，为实际种植中选择适宜浓度褪黑素缓解番茄病害、提高果实的品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验于2017年7月在北京市通州番茄种植园区进行，供试材料为番茄植株（Solanum lycopersicumcv. Ailsa Craig），生长正常，管理水平良好。

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，ACCC编号36028，使用之前于PDA平皿中培养10 d，长有灰色孢子时使用。

褪黑素、几丁质、蜗牛酶、昆布多糖、L-苯丙氨酸美国Sigma公司;抗坏血酸、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、Tween-80等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DW-YL270型-20 ℃低温冰箱、DW-HL340型-80 ℃超低温冰箱 中科美菱低温科技有限公司;高速台式冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;PB-10 pH计北京赛多利斯科学仪器有限公司;UV-1800紫外-可见光分光光度计 岛津医疗器械（北京）有限公司;KHW-D-1恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂;LX-B高压灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司;CFX96实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）仪 美国伯乐公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将植株按照开花时间标记花期，于开花后15 d喷施处理，喷施时将大棚内随机划分为5 个区域，并将各组处理进行隔离。将褪黑素溶解于蒸馏水中，配制成1、50、100 μmol/L和150 μmol/L的溶液，对照组为蒸馏水处理组，不同浓度褪黑素和蒸馏水分别喷洒于全株番茄植株，每株喷施100 mL。每隔7 d喷一次，共喷4 次，待果实成长为绿熟期果实（开花之后45 d左右）后采收大小均匀、形状和成熟度相对一致、无虫害、无机械损伤的果实，运回实验室。先放置12 h散去田间热，再将果实在体积分数3%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min消毒，清水洗净，晾干。每组选择10 个番茄果实，进行损伤接种。

损伤接种参照Yu Wenqing等[7]的方法，稍作修改。在无菌条件下，用含体积分数0.01% Tween-80的无菌水将PDA平板上的灰霉病原菌孢子洗脱下来，漩涡振荡，纱布过滤，用无菌水将孢子悬浮液的浓度调节至2×105～2×106CFU/mL备用。接种前，在超净台中用无菌的200 μL枪头在果实赤道部4 个方向分别扎直径2 mm、深度4 mm的小孔，然后注入10 μL的孢子悬浮液。接种后的番茄果实（25±1）℃、90%～95%相对湿度条件下贮藏，每天统计果实发病率和病斑直径，得到最适浓度，然后测定最适浓度处理组和对照组的其他指标，其中抗病相关酶活力和基因相对表达量测定时分别在0、2、4、8、16、24、72、120、168 h取样，营养指标测定在0、1、3、5、7 d取样。本实验重复两次。

1.3.2 发病率及病斑面积测定

发病率和病斑面积分别按公式（1）、（2）进行计算。

式中：d表示病斑直径/cm。

1.3.3 抗病酶活力测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、几丁质酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力的测定参照曹建康等[8]的方法。以每小时每克样品吸光度分别在290、420 nm波长处变化1为一个PAL、PPO活力单位（U），单位为U/g。以每秒钟每克样品中分解胶状几丁质产生1×10-9mol Glc-NAc为一个CHI活力单位，以每秒钟每克样品中酶分解昆布多糖产生1×10-9mol葡萄糖为一个GLU活力单位。以上酶活力单位均为U/g，结果以鲜质量计。

1.3.4 抗坏血酸、可溶性糖、可溶性蛋白、VC含量测定

抗坏血酸、可溶性糖、可溶性蛋白、VC含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。可溶性糖和可溶性蛋白含量的单位为mg/g，可滴定酸含量单位为g/100 g，VC含量单位为μg/g，结果均以鲜质量计。

1.3.5 抗病基因相对表达量测定

番茄果实总RNA提取、反转录和qPCR采用试剂盒方法进行。

番茄抗病相关基因PR1、NPR1、PI II和LoxD表达量分析参照Zhang Shujuan等[9]的方法进行，并加以修改。以SlACTIN7为内参基因，按照qPCR引物设计原则，参考表1设计特异性引物。

表 1 实时定量PCR的特异性引物序列Table 1 Sequences of specific primers used for quantitative polymerase chain reaction analysis

qPCR扩增体系为：1 μL cDNA样品、5 μL 2×Mix、0.3 μL上下游引物，双蒸水补至10 μL。CFX 96 qPCR仪中运行程序，扩增条件为：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，40 个循环;95～60 ℃（16 s）条件下分析溶度曲线。每个cDNA样品平行检测3 次。基因相对表达量的计算应用2-△△Ct方法计算。

1.4 数据处理与分析

应用Excel 2011软件统计分析所有数据，计算标准差并作图。应用SPSS 18.0软件对所有数据进行方差分析，利用邓肯氏多重比较法对数据进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 采前褪黑素处理对采后番茄果实抗病性的影响

图 1 采前褪黑素处理对番茄果实接种灰葡萄孢菌后发病情况的影响Fig. 1 Effect of pre-harvest melatonin treatment on the incidence of tomato fruit inoculated with Botrytis cinerea

如图1A所示，不同浓度褪黑素处理组番茄果实的病斑面积均不同程度小于对照组。如图1B所示，1、50、100、150 μmol/L褪黑素处理组在接种后3 d时的发病率比对照组分别低28.57%、28.81%、28.81%和57.14%（P＜0.05），6 d时的发病率分别比对照组低18.00%、21.66%、26.67%和36.00%（P＜0.05），随褪黑素处理浓度的升高，果实发病率降低。如图1C所示，接种3 d后，1、50、100、150 μmol/L褪黑素处理组的病斑面积比对照组分别低41.51%、52.03%、55.14%和58.50%（P＜0.05），6 d时的病斑面积比对照组分别低14.09%、22.61%、43.51%（P＜0.05）和5.94%。采前100 μmol/L褪黑素处理组在第6天的病斑面积最小，150 μmol/L褪黑素处理组的病斑面积与对照组无显著性差异（P＜0.05）。综上，采前适宜浓度的褪黑素喷施番茄植株，可以提高采后番茄果实的抗灰葡萄孢菌能力，其中100 μmol/L褪黑素处理效果最好。

2.2 采前褪黑素处理对采后番茄果实抗病相关酶活力的影响

图 2 采前褪黑素处理对采后番茄果实抗病相关酶活力的影响Fig. 2 Effect of pre-harvest melatonin treatment on disease resistancerelated enzyme activities in postharvest tomato fruit

CHI是高等植物体内水解病原菌细胞壁几丁质的酶，GLU能够降解真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖，PPO能催化酚类物质形成具有直接杀菌能力的醌类化合物，PAL是苯丙烷类代谢过程中的关键酶和限速酶，能促进酚类、木质素和植保素等重要抗菌物质的合成[10-13]。如图2A所示，采前褪黑素处理组番茄果实的CHI活力始终高于对照组，两组活力均在贮藏7 d（168 h）时达到最大值。如图2B所示，在采摘初期，褪黑素处理组果实的GLU活力高于对照组，在整个贮藏过程中，对照组和处理组的GLU活力都呈现先上升后波动下降的趋势，均在2 h时出现活力高峰，处理组的GLU活力高峰值显著高于对照组（P＜0.05）。如图2C所示，除了4 h时，在整个贮藏过程中，褪黑素处理组的果实PPO活力均显著高于对照组（P＜0.05）。如图2D所示，在0 h，褪黑素处理组PAL活力高于对照组，贮藏1 d时，对照组果实PAL活力到达最高值，处理组PAL活力处于最低值。之后的贮藏过程中，对照组果实的PAL活力逐渐下降，而处理组的活力逐渐上升。第7天时，处理组的GLU活力达到最高值，高于对照组最高值。以上结果表明，采前褪黑素处理提高了采后番茄果实CHI、GLU、PPO、PAL的活力。

2.3 采前褪黑素处理对采后番茄果实抗病相关基因表达量的影响

图 3 采前褪黑素处理对采后番茄果实抗病相关基因表达量的影响Fig. 3 Effect of pre-harvest melatonin treatment on the gene expression associated with disease resistance in postharvest tomato fruit

病程相关蛋白受到病原菌侵染或非生物胁迫诱导时产生。NPR1是植物体内水杨酸、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）抗病信号传导网络的关键点，在水杨酸诱导的抗病途径中起关键作用[14-15]。PI II基因是JA信号途径上的一个重要基因[16]，而其活跃表达也说明抗病信号传导与该途径具有密切关系。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是茉莉酸途径的关键酶和限速酶[17]。如图3A所示，褪黑素处理组果实基因PR1相对表达量呈现先上升后下降的趋势。在整个贮藏期内，褪黑素处理组果实PR1的相对表达量始终高于对照组，两组基因相对表达量均在4 h时达到峰值，此时处理组的PR1基因表达量是对照组的2 倍。如图3B所示，褪黑素处理组果实的NPR1相对表达量呈现先升高后下降的趋势，对照组呈现波动降低的趋势。在整个贮藏过程中，处理组果实的NPR1表达量略高于对照组。如图3C所示，在贮藏的过程中，处理组果实的PI II相对表达量高于对照组，两组均先增后降。如图3D所示，在贮藏2 h时，两组LoxD相对表达量都达到了峰值，褪黑素处理组的LoxD相对表达量峰值是对照组的4 倍。贮藏2 h之后，两组的LoxD相对表达量都骤降且趋于平稳，褪黑素处理组的LoxD表达水平略高于对照组。

2.4 采前褪黑素处理对采后番茄果实品质的影响

VC、有机酸、可溶性糖和可溶性蛋白在植物的生物和非生物胁迫中发挥重要作用，且其含量是衡量果蔬营养品质的重要指标[18-24]。如图4A所示，褪黑素处理组和对照组VC含量均随贮藏时间延长呈现先上升后下降的趋势，在整个贮藏过程中，处理组果实的VC含量始终显著高于对照组（P＜0.05）。如图4B所示，处理组和对照组可滴定酸含量的变化范围为0.27～0.40 g/100 g，均呈现逐渐上升的趋势，从采收一直到贮藏7 d，处理组的可滴定酸含量显著高于对照组（P＜0.05）。如图4C所示，对照组可溶性糖含量在贮藏期逐渐升高，0～1 d是缓慢上升期，1～5 d是快速上升期，5 d之后逐渐稳定;处理组在0 d时可溶性糖含量即高于对照组，0～1 d是快速增长期，之后趋于稳定，在贮藏过程中，处理组的可溶性糖含量均高于对照组。如图4D所示，在贮藏过程中，处理组的可溶性蛋白含量呈现先上升后下降的趋势，对照组呈现先下降后缓慢上升的趋势。处理组和对照组可溶性蛋白含量的最高值分别在贮藏的1、0 d，且处理组的峰值略高于对照组，处理组可溶性蛋白含量在1 d和3 d时高于对照组。上述结果表明，采前褪黑素处理提高了采后番茄果实的贮藏品质。

图 4 采前褪黑素处理对采后番茄果实品质相关指标的影响Fig. 4 Effect of pre-harvest melatonin treatment on quality indicators of postharvest tomato fruit

3 讨 论

本实验采用不同浓度褪黑素对开花之前的番茄植株进行采前喷施，以采后绿熟期番茄果实作为实验材料。从实验结果来看，外源褪黑素采前处理可以降低采后番茄果实灰霉病的发病率和病斑面积，其中100 μmol/L的采前褪黑素抗病效果最好。贮藏过程中，采前褪黑素处理能够提高果实的PAL、CHI、GLU和PPO活力，并不同程度地提高抗病相关基因（PR-1、NPR1、PI II、LoxD）的相对表达量，可初步判断褪黑素同时通过SA和JA/ET两条途径导致植物产生抗病性，但其诱导机制需要进一步的实验验证。

褪黑素处理采后果实能够提高番茄[25]、草莓[26]的营养品质，同时研究表明，褪黑素采前处理番茄植株可以提高采后果实的质量，提高果实内部有机酸、VC的含量[27]，与本实验发现用褪黑素采前处理能够提高采后番茄果实的可溶性糖、可滴定酸、蛋白质含量、VC含量的结果相一致，说明褪黑素采前处理可以一定程度上改善采后番茄果实的品质。

综上，在采前对番茄植株喷施适宜浓度褪黑素可有效提高采后番茄果实对灰葡萄孢菌的抗性、抗病相关酶活力和番茄的贮藏品质。