HPLC法同时测定采后莲雾果实木质素代谢途径中5 种酚酸的含量

匡凤元，吴光斌，张 珅，黄利娜，陈发河

（集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361000）

莲雾（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill & L.M.Perry）又名洋蒲桃、甜雾等[1]，是来自桃金娘科蒲桃属的热带水果[2]，原产于马来半岛，我国台湾最早引入[3]。莲雾果实富含酚类和类黄酮等物质，具有较高的营养价值和经济价值[4]。但是，莲雾采后呼吸代谢旺盛，果肉易发生絮状绵软症状，造成品质劣变而失去商业价值[5-6]。莲雾贮藏期间木质素代谢是造成采后果实絮状绵软症状的重要影响因素[7-9]。

木质素是酚类聚合物，主要由苯丙烷代谢途径生成。肉桂酸经L-苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）催化脱氨基生成，在肉桂酸-4-羟化酶（trans-cinnamate 4-monooxygenase，C4H）、香豆酸-3-羟基化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）、阿魏酸-5-羟化酶（ferulate-5-hydroxylase，F5H）、咖啡酸-O-甲基转移酶（caffeic acid-O-methyltransferase，COMT）等关键酶的作用下生成对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等酚酸，酚酸继续在苯丙烷代谢途径中各种酶的作用下合成木质素[10-11]。植物中的酚酸是以游离、游离的酯和共轭（结合）形式存在于果蔬中[12-13]。在这3 种形式中，游离和游离的酯酚酸是可溶性酚酸。游离酚酸可直接从甲醇、乙醇或丙酮中提取；游离酯是通过酯键与可溶性糖或小分子连接的酯；共轭酚酸通过酯键与细胞壁结合，酯键可以使用碱水解提取[14]。目前，果蔬中酚酸的测定方法主要有分光光度法[15]、气相色谱法[16]和毛细管电泳法[17]等。分光光度法定量准确性较差，只能用于同类型结构酚酸类物质含量的测定，不能区分结构相似的单一酚类物质，而且易受样品中其他杂质的影响。气相色谱法具有操作简单、灵敏度高、分离效能高等优点，韩雪等[16]用气相色谱法对红枣中6 种酚酸进行了定性和定量分析。但是酚酸类化合物属于极性化合物，要对酚酸类化合物进行气相色谱分析并且获得好的出峰效果，必须先通过衍生化处理以降低样品极性，而衍生化时间过长会导致样品中酚酸含量测定产生较大的误差。毛细管电泳法虽然具有快速、高效、所需样品量小等优点，但是其重现性较差，不适用于酚酸的定量测定。而高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）不仅具有使用方便、准确度高和高度重现性的优点，而且可以区分结构类似的单一酚酸类化合物，是目前测定酚酸类化合物常用的分析技术[18]。国内外现有研究通过HPLC法测定了猕猴桃[21]、番茄[22]、火龙果[23]和荔枝[24]等水果中所含酚酸种类及含量；骆成尧等[19]运用反相HPLC法同时测定马铃薯中的绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸含量，但是仅测定了马铃薯中的游离酚酸；饶国栋等[20]通过HPLC测定方法对烟草木质素代谢途径中相关植物酚酸进行了研究。关于利用HPLC法同时测定莲雾木质素代谢途径中5 种关键中间产物酚酸（肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸）的方法鲜见报道。本实验采用HPLC方法同时测定采后莲雾果实木质素代谢途径中5 种关键中间产物酚酸含量，探讨这5 种酚酸在采后莲雾中的含量变化，旨在为进一步探究莲雾果实贮藏期间木质素代谢的调控机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以当日抵达福建省厦门市中国台湾水果集散中心的中国台湾“黑珍珠”莲雾（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill & L.M. Perry）为材料。选择形状大小、成熟度基本一致、没有病虫害且无机械损伤的莲雾，置于恒温恒湿箱中贮藏12 d（温度（4±0.5）℃、相对湿度（85±2）%。

肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸对照品（纯度≥98%） 北京索莱宝科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国Sigma公司；乙醇、乙酸、乙醚、乙酸乙酯（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

2695 HPLC仪（配2489 紫外检测器） 美国Waters公司；高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Cary50紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；RIOS 8超纯水系统 美国Millipore公司；PE20K型pH计 瑞士Mettler Toledo公司；RE旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；KQ数控超声波清洗机 昆山市超声波仪器有限公司；LHS智能恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司；WB-14恒温水浴锅 德国Memmert公司；LGJ冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司；ULT1386 -80 ℃超低温冰箱 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

乙酸溶液（pH 2.4）：超纯水用乙酸调节pH值至2.4，用0.45 μm的水相滤膜过滤后超声。

单一标准储备液：配制质量浓度为800 mg/L的5 种酚酸标准品（肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸），-20 ℃保存。

混合标准工作液：分别移取适量的各单一标准储备液，用甲醇溶液稀释至2、4、8、16、32、64 倍，得到梯度混合标准液。

1.3.2 样品的提取

游离酚酸的提取：精密称取莲雾冻干粉末1 g，用20 mL甲醇在40 Hz常温超声提取30 min，之后10 000 r/min离心10 min，取上清液，共重复提取3 次，收集取得的上清液即为游离酚酸提取液。

结合酚酸的提取：参照Luo Chunying等[18]的方法进行。将上述离心得到的沉淀加入25 mL提取液（24 mL 4 mol/L NaOH溶液＋0.4 mL 1%抗坏血酸溶液＋0.6 mL 10 mmol/L EDTA溶液），然后将其用氮气保护，密封并在室温下搅拌约16 h。将反应完成的溶液用4 mol/L的HCl溶液调节至pH值为2，然后用15 mL乙醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）的混合物萃取3 次，合并萃取液在10 000 r/min离心10 min，收集上清液为碱解所得到的结合酚酸提取液。继续将上述离心沉淀在85 ℃用50 mL 4 mol/L HCl溶液水解30 min，待混合物冷却后用4 mol/L NaOH溶液调节至pH值为2，然后用15 mL乙醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）的混合物重复萃取3 次，合并萃取液在10 000 r/min离心10 min，收集上清液为酸解所得到的结合酚酸提取液。

将上述所得3 种粗提取液混合后用旋转蒸发仪在40 ℃旋蒸。蒸干后，用2 mL甲醇复溶，最后过0.22 μm微孔滤膜备用。

1.3.3 HPLC条件

色谱条件：InfinityLab Poroahell C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），流动相为pH 2.4的乙酸溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脱（0～32 min，10%～20% B；32～40 min，20%～40% B；40～45 min，40% B；45～48 min，40%～10% B；48～55 min，10% B），柱温25 ℃，流速0.8 mL/min，检测波长为320 nm和279 nm，进样量15 μL。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理，使用Adobe Photoshop软件对图像进行处理。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

考察了Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Atlantis T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和InfinityLab Poroahell C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）在pH 2.4乙酸溶液（A）-甲醇溶液（B）梯度洗脱条件下的分离效果。结果显示，Atlantis T3色谱柱的分离效果稍差；而Symmetry C18柱和InfinityLab Poroahell C18色谱柱的分离效果较好。又因InfinityLab Poroahell C18色谱柱的柱子较短，分析时间短，节省流动相和时间，且峰形较好，因此本实验选取InfinityLab Poroahell C18色谱柱。

2.2 检测波长的选择

5 种酚酸标准品溶液的紫外区全波长扫描结果显示，肉桂酸在279 nm波长处有特征吸收，对香豆酸在290 nm波长处有特征吸收，其他3 种酚酸在320 nm波长左右区域有吸收峰，综合考虑，本实验选用279 nm和320 nm作为定量检测波长。

2.3 流动相体系的选择

酚类物质的HPLC分析常采用甲醇-水溶液或者乙腈-水溶液作为流动相。由于流动相B中水的比例过大，容易使有机酚酸类化合物发生电离，从而使色谱峰形拖尾变宽且不对称。在流动相中加入酸性抑制剂可以抑制这种化合物的电离，增大其分布系数，各组分色谱峰的峰形和分离度都得到明显的改善，保留时间也相应增加，而酸性抑制剂的种类、浓度以及流动相组成都与分离效果有关。因此实验比较了pH值均为2.6的甲酸溶液、乙酸溶液、磷酸溶液对目标组分的分离效果，结果显示流动相为甲酸溶液和磷酸溶液时，芥子酸和阿魏酸的分离度均小于1，而流动相为乙酸溶液时，芥子酸和阿魏酸的分离度为1.2。考虑到酸性抑制剂的浓度会影响色谱峰的分离度，实验进一步考察了乙酸溶液的pH值为2.4、2.5、2.6、2.7对5 种酚酸的保留时间及分离效果的影响。结果表明，当pH值为2.4时芥子酸和阿魏酸的分离度大于1.5，满足实验要求。因此综合以上条件选择pH值为2.4的乙酸溶液为流动相B。经实验比较，流动相甲醇与乙腈的分离效果差不多，考虑到甲醇的价格较低和样品的溶剂效应，因此采用甲醇做为流动相。

本实验首先采用等度洗脱的方式，结果发现目标成分很难与干扰峰有效的分离，而采用梯度洗脱的方式，则有较大改善。当采用1.3.3节梯度洗脱条件时，肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸5 个峰能与干扰峰有效的分离，达到实验要求。

在上述优化的液相色谱条件下对标准品和实际样品进行测定，5 种酚酸标准品及莲雾提取液的液相色谱图见图1、2，其相邻峰的峰形较好，分离度较好。

图 1 5 种酚酸标准品在279 nm（A）和320 nm（B）波长处的色谱图Fig. 1 Chromatograms of 5 phenolic acid standards at 279 (A) and 320 nm (B)

图 2 莲雾提取液在279 nm（A）和320 nm（B）波长处的色谱图Fig. 2 Chromatograms of wax apple extract at 279 (A) and 320 nm (B)

2.4 标准曲线、线性范围和检出限测定结果

在优化的实验条件下，对不同质量浓度的5 种酚酸标准品进行测定。以各酚酸组分的峰面积为纵坐标（y），对应质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，根据信噪比确定检出限（RSN＝3）以及定量限（RSN＝10）。如表1所示，5 种酚酸标准品呈现良好的线性关系，其相关系数范围为0.999 4～0.999 9，检出限为0.01～0.03 mg/kg，定量限为0.03～0.09 mg/kg。

表 1 酚酸组分的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges,limits of detection and limits of quantitation of phenolic acids

2.5 回收率和精密度测定结果

向已知5 种酚酸含量的莲雾样品中分别加入高、中、低3 个水平的混合标准品，按照1.3.2节方法处理。每个加标水平平行测定6 次，计算相应组分的加标回收率和相对标准偏差，见表2。结果显示，5 种酚酸的加标回收率为86.18%～99.05%，相对标准偏差均小于5%，说明该方法精密度良好，准确度高。

表 2 酚酸组分的加标回收率（n=6）Table 2 Average recoveries of phenolic acids in spiked water (n= 6)

2.6 样品测定结果

采用上述优化的实验方法，对采后莲雾果实贮藏期间5 种酚酸含量进行测定，结果见表3，5 种酚酸含量的相对标准偏差均小于5%。莲雾贮藏期间肉桂酸的含量不断下降，含量变化范围11.46～24.69 mg/kg、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量变化趋势为先上升后期下降，其含量变化范围分别为0.92～1.45、2.31～5.32、8.86～20.58 mg/kg和9.48～22.62 mg/kg。已有研究表明酚酸浓度的变化取决于水果的成熟度，Seraglio等[25]发现树葡萄、爪哇梅等蒲桃科植物的酚类化合物的最高浓度通常出现在中间成熟期。果实成熟收获后开始出现软化或者出现木质化现象，这与成熟过程中果实细胞壁物质降解和苯丙烷代谢等次生壁代谢有关，酚酸类物质作为苯丙烷代谢途径中木质素合成的重要中间产物，很大程度影响果实中木质素的合成。王斌[26]对砀山酥梨果实木质素代谢的研究表明，梨果实发育后期阿魏酸和芥子酸含量大幅度降低，并且在木质素合成高峰期下降速率最高。本研究测得采后莲雾果实木质素合成途径中5 种酚酸含量的大小顺序为肉桂酸＞芥子酸＞阿魏酸＞咖啡酸＞对香豆酸，并且它们的含量变化除肉桂酸在贮藏期间不断下降外，其余4 种酚酸均呈现先上升后下降的趋势，这与采后莲雾果实木质素含量增加及絮状绵软进程相一致，此结果也与Elmastas等[27]和王斌[26]在其他果实上的检测结果类似。酚酸含量的变化说明更多的木质素合成前体进入到木质素合成途径中，使木质素含量升高，最终导致果实木质化现象加重。

表 3 样品中5 种酚酸含量（n=3）Table 3 Contents of five phenolic acids in stored wax apple samples (n= 3)

3 结 论

本实验采用超声辅助酸碱水解法，最大限度地提取了莲雾果实中的游离及结合酚酸类化合物，并实现了利用HPLC法对莲雾果实木质素合成途径中肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸5 种关键酚酸类化合物的同时定量测定。本实验建立的HPLC法，采用InfinityLab Poroahell C18色谱柱为固定相，以甲醇和乙酸溶液（pH 2.4）为流动相进行梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温25 ℃，紫外检测器波长279 nm和320 nm。各酚酸组分的线性范围较宽，相关系数为0.999 4～0.999 9，检出限为0.01～0.03 mg/kg，定量限为0.03～0.09 mg/kg，相对标准偏差低于5%，加标回收率为86.18%～99.05%。测定了采后莲雾贮藏期间5 种酚酸的含量变化，结果表明，贮藏期间肉桂酸的含量不断下降，含量变化范围为11.46～24.69 mg/kg，对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量变化趋势为先上升后期下降，其含量变化范围分别为0.92～1.45、2.31～5.32、8.86～20.58 mg/kg和9.48～22.62 mg/kg。

酚酸类化合物是一组复杂多样的二级植物代谢物，分为游离和结合方式存在[28]。文献中大多以甲醇或丙酮直接萃取获得酚酸提取液，忽视了结合酚酸的提取，往往造成酚酸类物质的定性和定量不准确[19-20]。同时，酚酸类化合物作为木质素代谢途径中的重要中间产物，很大程度上影响果实中木质素的合成[29-30]。酚酸的定性和定量分析是开展木质素代谢研究的基础[31]。本研究建立的利用HPLC法分析采后莲雾果实木质素合成途径中酚酸的方法使5 种酚酸得到很好的分离，准确度和精密度好，灵敏度和回收率高，操作简便。本研究结果为进一步探究莲雾果实贮藏期间木质素代谢的调控机理提供参考。