北京油鸡鸡汤滋味物质分析

王天泽，谭 佳，杜文斌，甄大卫，谢建春

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学，北京 100048）

鸡肉具有胆固醇含量低、蛋白质含量高、氨基酸种类全等特点，深受大众喜爱[1-2]。北京油鸡，又名中华宫廷黄鸡，是北京地区特有的肉蛋兼用型鸡种。在炖煮过程中鸡肉可释放小肽、游离氨基酸、无机盐、核酸代谢物等物质，以赋予鸡汤一定的风味和营养特性，使得鸡汤滋味鲜美可口，营养价值提高[3]。与其他众多品种鸡肉相比，北京油鸡鸡肉肉质细嫩、味道鲜美，尤其炖煮鸡汤风味更佳[4]。

目前，对于鸡汤中呈味物质的研究已有一些相关报道。如王琳涵等[5]采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析不同煮制时间鸡汤呈味物质变化，发现在5 h内5’-胞苷酸（5’-cytidylate monophosphate，5’-CMP）、5’-鸟苷酸（5’-guanosine monophosphate，5’-GMP）、乳酸和游离氨基酸含量随着煮制时间的延长而增加，而5’-肌苷酸（5’-inosinemonphosphate，5’-IMP）和5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，5’-AMP）含量分别在煮制2、3 h时达最大值，且煮制4 h的鸡汤滋味最佳。Qi Jun等[6]用HPLC和电感耦合等离子体发射光谱仪分析炖煮时间对黄羽鸡鸡汤中游离氨基酸、5’-IMP和矿物质的影响，发现5’-IMP和氯化物含量均随炖煮时间延长而增加。杨肖等[7]用HPLC法分析不同加盐方式所得鸡汤呈味物质，发现煮制前加盐的鸡汤中5’-CMP、5’-GMP、乳酸、琥珀酸和游离氨基酸含量最高，鸡汤的整体风味最好。

肉汤滋味是汤中各种具有不同风味物质的综合作用结果。研究表明[8]，构成鸡汤滋味的风味物质主要包括游离氨基酸、核苷酸、呈味肽。先前本课题组通过稀释法/气相色谱-嗅闻法，研究了北京油鸡鸡汤的香气活性化合物构成[4]。本实验将采用HPLC法分析鸡汤中的游离氨基酸、呈味核苷酸组成，采用葡聚糖凝胶色谱分离、高效凝胶色谱测分子质量分布、基质辅助激光解析-高分辨质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）结构鉴定研究北京油鸡鸡汤的呈味肽组分，以期为模拟北京油鸡鸡汤风味品质特性、制备高品质肉味香精提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北京油鸡 北京百年栗园生态农业有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-15 美国GE Healthcare公司；甲酸、乙腈、甲醇、三氟乙酸（均为色谱纯） 赛默飞世尔科技有限公司；二水合5-磺基水杨酸、磷酸氢二钠、硼酸钠、甲酸铵（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；17 种氨基酸标准品（分析纯） 美国Sigma公司；氨基酸分析衍生试剂邻苯二甲醛溶液（10 mg/mL）、9-芴甲基氯甲酸酯溶液（2.5 mg/mL） 美国Agilent公司；多肽标准品混合液含乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、杆菌酶（1 450 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、细胞色素（12 500 Da） 上海曦玉分析仪器科技有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（纯度99%）德国Merk公司。5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP（纯度均为99%） 北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机 德国Christ公司；3-30K高速离心机 美国Sigma公司；1200型HPLC仪 美国Agilent公司；PHSJ-3F实验室pH计 上海仪电有限公司；5800型MALDI-TOF MS仪 美国AB Sciex公司；MD-99自动液相色谱分离仪 上海青浦沪西仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

北京油鸡（1 kg）去除内脏、清水洗净后，按质量比1∶2将油鸡和水置于炖煮锅中，95 ℃炖煮3 h。炖煮后将鸡汤过滤，石油醚（1∶1，V/V）萃取3 次除脂，再冻干成粉待用。

1.3.2 游离氨基酸分析

取3 g冻干粉置于烧杯中，加入32 mL磺基水杨酸溶液（质量浓度36 g/L）混匀，静置10 min，0 ℃、20 000 r/min离心15 min，取上清液，0.22 μm聚醚砜膜过滤，待分析。

HPLC条件：Poroshell HPH-C18分析柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温40 ℃；流速1.5 mL/min；二极管阵列检测器，检测器程序：0～11.0 min，波长338 nm；11.0～18.0 min，波长262 nm（仅用于分析脯氨酸）。流动相A：10 mmol/L磷酸氢二钠-10 mmol/L硼酸钠缓冲液（pH 8.2）；流动相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）；梯度洗脱程序：0～0.35 min，2% B；0.35～13.4 min，2%～57% B；13.4～13.5 min，57%～100% B；13.5～15.7 min，100% B；15.7～15.8 min，100%～2% B；15.8～18.0 min，2% B。衍生化试剂：9-芴甲基氯甲酸酯和邻苯二甲醛，质量浓度分别为2.5、10 mg/mL；进样1 μL。重复测定3 次。

将氨基酸标准品用蒸馏水逐级稀释，配制胱氨酸标准溶液浓度为1.250、0.625、0.313、0.156、0.078 μmol/mL，其他16 种氨基酸标准溶液浓度为2.500、1.250、0.635、0.313、0.150 μmol/mL。以浓度（μmol/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制17 种氨基酸标准曲线，外标法进行定量分析。

1.3.3 核苷酸测定

样品为冻干粉加蒸馏水复溶的鸡汤，质量浓度25 mg/mL。HPLC条件：Waters Xbridge Amide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；柱温40 ℃；流动相为0.01 mol/L甲酸铵溶液（pH 4.5）-乙腈（15∶85，V/V）；流速1.0 mL/min，等度洗脱15 min；二极管阵列检测器，检测波长260 nm；进样20 μL。重复测定3 次。

采用外标法定量分析。用蒸馏水配制5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP的混合标准溶液储备液16 mg/100 mL，然后稀释为0.5、1、2、4、8 mg/100 mL。以质量浓度（mg/100 mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

加标回收实验：准备4 份鸡汤样品，3 份分别加入5’-AMP、5’-GMP和5’-IMP标准品至最终质量浓度2.5、37、1.5 mg/100 mL，1 份作为空白实验。4 份样品均采用以上HPLC条件进样分析。

1.3.4 葡聚糖凝胶色谱分离

装有Sephadex G-15葡聚糖凝胶的色谱柱（玻璃管3.0 cm×60 cm），超纯水洗脱，流速3.0 mL/min，紫外检测波长220 nm，鸡汤除脂冻干粉用蒸馏水配成质量浓度100 mg/mL的溶液，经0.45 μm聚醚砜膜过滤上样，上样量5 mL。根据检测到的谱峰进行馏分收集，共收集了3 个谱峰的馏分，收集到的馏分冻干待用。

1.3.5 高效凝胶液相色谱分析

取一定量的1.3.4节获得的冻干馏分以及一定量的原始鸡汤除脂冻干粉，用蒸馏水配成质量浓度为10 mg/mL溶液，过0.22 μm聚醚砜膜后，待HPLC分析。

色谱柱TSK gel G2000 SWXL柱（7.8 mm×300 mm，5 μm）；流动相为水-乙腈-三氟乙酸（80∶20∶0.1，V/V）；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；二极管阵列检测器，检测波长220 nm。

绘制分子质量校正曲线所用标准品：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、杆菌酶（1 450 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、细胞色素（12 500 Da）。标准曲线：lgm＝-0.294 7x＋6.858 3，R²＝0.997 2（m为分子质量/Da，x为保留时间/min）。将样品组分HPLC分析的保留时间代入此方程，计算分子质量m。

1.3.6 感官评价

取一定量1.3.4节获得的冻干馏分以及一定量的原始鸡汤除脂冻干粉，加蒸馏水配成质量浓度10 mg/mL的溶液，待分析。感官评价小组由6 位经培训后筛选出的具有感官分析经验的成员组成，年龄在21～27 周岁，其中男性3 人，女性3 人。滋味评价描述词为：鲜味、甜味、苦味、咸味、醇厚感和持续性。滋味强度分为5 个等级：无味、弱、一般、较强、强。评价小组成员先用纯净水漱口后，取2～3 mL样品置于口中，15 s后吐出，2 个样品评价时间间隔2 min。

1.3.7 MALDI-TOF MS分析

经葡聚糖凝胶柱分离收集的2#峰馏分冻干的样品，加蒸馏水配成10 mg/mL溶液。5800型MALDI-TOF MS仪，以60%乙腈溶液配制的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液作为基质，将基质溶液与样品溶液1∶1（V/V）混合，取1 μL点在MALDI靶板上，在室温下自然干燥。

一级质谱分析：激光光源为固态激光光源，脉冲加速电压7 kV，波长349 nm，采用正离子反射模式采集数据，分子质量扫描范围200～3 000 u。二级质谱（MS/MS）分析：选择一级谱中强度高的母离子峰（m/z522.561 6、550.592 5、888.085 4和935.977 8），加速电压2 kV，采用CID碰撞裂解获取母离子的离子碎片。根据母离子及其碎片峰，推测呈味肽组分结构。

1.4 数据处理

图表采用Microsoft Excel 2017软件绘制。游离氨基酸、核苷酸含量均为3 次测定结果的平均值。各种氨基酸的呈味特性参照文献[9]。游离氨基酸或呈味核苷酸的滋味活性值（taste active value，TAV），采用测定浓度除以阈值计算得到[6]。氨基酸、核苷酸的呈味阈值参考文献[8]。

2 结果与分析

2.1 鸡汤的游离氨基酸组成

如表1所示，按照滋味类型，分为鲜、甜、苦、无味氨基酸。鸡汤中质量浓度最高的为丙氨酸（60.79 mg/100 mL），其次为酪氨酸（54.84 mg/100 mL）、谷氨酸（53.66 mg/100 mL）等，其中鲜、甜味氨基酸总量为201.75 mg/100 mL，占比为54.52%；苦味氨基酸总量为127.58 mg/mL，占比为34.47%。据报道[6]，滋味鲜美的黄羽鸡炖煮鸡汤中，含量最高的为赖氨酸，其次为谷氨酸，而鲜甜味氨基酸占比（49.28%）也远高于苦味氨基酸占比（8.45%），与炖煮北京油鸡鸡汤一致。但炖煮三黄鸡鸡汤与北京油鸡鸡汤不同，其含量最高的为组氨酸，其次为谷氨酸、丙氨酸，而鲜甜味氨基酸占比为39.85%，苦味氨基酸占比48.10%[8]，即苦味氨基酸占比高于鲜甜味氨基酸。以上游离氨基酸组成的特点可能是造成北京油鸡鸡汤滋味佳的原因之一。

表 1 鸡汤中游离氨基酸组成Table 1 Composition of free amino acids in chicken broth

物质对滋味的贡献可采用TAV进行评估，一般TAV值大于1时，该成分对样品滋味有贡献；当TAV值小于1时，该成分对样品滋味几乎无贡献。由表1可知，所有氨基酸中，仅鲜、甜味氨基酸谷氨酸和丙氨酸的TAV值大于1，分别为1.79和1.01，说明二者对鸡汤滋味贡献大。苦味氨基酸中的最高TAV值仅为0.69（组氨酸），且异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸TAV值均很小（＜0.1）。另外，鲜、甜味氨基酸TAV值总和大于苦味氨基酸TAV值总和。以上TAV分析进一步表明，鲜甜味游离氨基酸占比高可能是北京油鸡鸡汤有较强鲜味的原因之一。

2.2 鸡汤中核苷酸含量

核苷酸是肉中主要呈鲜味物质之一，其中代表性呈鲜味核苷酸主要为5’-AMP、5’-IMP和5’-GMP[10]。核苷酸常采用C18反相色谱柱方法测定[11-13]，如Qi Jun等[6]先采用高氯酸溶液前处理，然后C18反相色谱柱分析了黄羽鸡炖煮鸡汤的核苷酸组成。C18反相色谱柱方法缺陷是使用磷酸盐溶液作流动相，不利于液相色谱泵的寿命，且对于有些样品分离效果欠佳[14]。

Amide柱采用键合酰胺官能团固定相，分离机理为近年发展的替代反相色谱，用于强极性亲水性化合物分离的亲水作用色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）模式。常使用有机溶剂-水作流动相，能较好地分离极性化合物如氨基酸和核酸等[15-16]。本实验尝试用Amide柱，以乙腈-甲酸铵为流动相对未经前处理的样品中的5’-AMP、5’-IMP和5’-GMP进行分析，所得HPLC图见图1，测定结果如表2。可知样品组分得到了较好分离，且基质干扰较小。进一步在所测定核苷酸含量范围，采用加标回收方法验证准确性，得出3 种核苷酸的加标回收率为93.5%～101.3%，表明此分析方法可靠。

图 1 鸡汤中3 种核苷酸含量的HPLC图Fig. 1 HPLC chromatograms of three nucleotides in chicken broth

表 2 鸡汤中3 种核苷酸含量Table 2 Contents of three nucleotides in chicken broth

据文献报道，鸡肉中5’-IMP是含量高的核苷酸[17]，蘑菇中5’-AMP为含量高的核苷酸[18-19]，马铃薯中5’-GMP及5’-AMP为含量高的核苷酸[14]，螃蟹、鱿鱼中5’-AMP为含量高的核苷酸[20-22]。由表2可知，与鸡肉的核苷酸组成类似，在鸡汤中检测的3 种核苷酸也是5’-IMP含量高。3 种核苷酸中5’-IMP的TAV值大于1，而5’-AMP和5’-GMP的TAV值均小于1，说明主要是5’-IMP对鸡汤的滋味有贡献。同样，黄羽鸡鸡汤中也是5’-IMP对鸡汤的滋味有主要贡献[6]。

此外，鲜味氨基酸如谷氨酸钠和核苷酸之间具有协同作用，可增强鸡汤的鲜味[23]。尤其检测到的北京油鸡鸡汤中5’-IMP含量最高，可与丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸等甜味氨基酸产生协同作用，增强鸡汤鲜味[24]。核苷酸中5’-AMP虽TAV值小于1，但其在低浓度时具有甜味，与5’-IMP之间可产生协同作用使鸡汤鲜味增强[25]。

2.3 呈味肽组分的分离鉴定

2.3.1 鸡汤中呈味肽组分的分离

图2为鸡汤经葡聚糖凝胶色谱分离所得色谱图。收集谱1#～3#峰的馏分，冻干，高效凝胶液相色谱测定分子质量分布，并以原始鸡汤的脱脂冻干粉样品为对照，进行感官评价，结果如表3所示。

图 2 鸡汤经葡聚糖凝胶分离色谱图Fig. 2 Chromatograms of chicken broth separated on Sephadex G-15

表3 鸡汤及其葡聚糖凝胶色谱分离收集馏分的分子质量分布、滋味比较Table 3 Molecular mass distribution and taste of chicken broth and fractions from Sephadex G-15 chromatographic separation

由表3可以看出，未经分离的鸡汤有较强的鲜味、甜味、醇厚感和持续性，而分离得到的1#峰几乎无味，2#峰有比鸡汤更强的鲜味和类似鸡汤的甜味、醇厚感和持续性，3#峰有稍弱于鸡汤的鲜味和甜味，但无醇厚感和持续性。未经分离的鸡汤主要为分子质量＞5 kDa和1～3 kDa的组分；1#峰样品分子质量＞5 kDa的组分百分比高于鸡汤，＜3 kDa的组分百分比显著低于鸡汤；2#峰和3#峰样品＞5 kDa的组分百分比均显著低于鸡汤，＜3 kDa的组分百分比均显著高于鸡汤，尤其2#峰的＜3 kDa的组分百分比又高于3#峰。

呈味肽通常为＜3 kDa的寡肽类物质[26-28]，1#峰中＞5 kDa的组分为主，因此导致其几乎无味。2#峰和3#峰＞5 kDa的组分均很少，二者滋味差异可能与＜3 kDa的组分所占百分比不同有关，还可能与组成二者的多肽种类和结构不同有关。

2.3.2 鸡汤中呈味肽组分结构鉴定

对呈味最强的2#峰样品进行分析，先采用MADLITOF MS进行一级质谱分析，再选择一级质谱图中丰度较高的峰进行二级质谱分析[29]。由图3a可知，一级质谱显示2#峰样品中，丰度高的主要为＜1 kDa的多肽，且集中在m/z500和900周围质谱峰的丰度强，包括m/z911、935、550、888、522。对4 个质谱峰进行碰撞诱导解离，得到的二级质谱图，如图3b～e所示。

根据一级质谱母离子及其对应的二级质谱碎片推断结构。按照肽的质谱裂分规律[30]，如表4所示，a、b、c、x、y、z方式断裂的肽段离子均被检测到。鉴定出的m/z550.590 0、888.080 0、935.970 0 3 个肽均含有鲜味氨基酸谷氨酸或甜味氨基酸丙氨酸，这与游离氨基酸分析结果一致。另外，m/z522.560 0、888.080 0、935.970 0 3 个肽还含有鲜味氨基酸谷氨酰胺，也有利于肽呈鲜味。

表 4 2#峰中肽的可能氨基酸组成Table 4 Possible amino acid composition of peptides in peak 2#

图 3 2#峰的MALDI-TOF一级质谱图（a）及m/z 522.56、550.59、888.08和935.97对应的二级质谱图（b～e）Fig. 3 Mass spectrum (a) of peak 2# and tandem mass spectra (b–e) of peaks at m/z 522.56, 550.59, 888.08 and 935.97 as shown in (a)

3 结 论

北京油鸡炖煮鸡汤中鲜、甜味游离氨基酸占比及TAV均远大于苦味氨基酸，这可能是鸡汤滋味较佳原因之一。尤其谷氨酸和丙氨酸含量最高且TAV值大于1，对鸡汤鲜味贡献最大；呈味核苷酸中5’-IMP含量最高且TAV值大于1，对鸡汤滋味贡献大。

尽管鸡汤中分子质量＞5 kDa和1～3 kDa的肽组分含量高，二者占比达85.85%，但采用葡聚糖凝胶色谱分离收集馏分，发现鲜味、醇厚感和持续性均最强的组分主要为寡肽类（＜3 kDa），占比达84.29%。

对最强的呈味馏分采用MALDI-TOF MS/MS分析，鉴定出4 个肽，分别为Leu-Val-Gln-Tyr、Val-His-Ala-His-Ser、Ala-Gln-Asn-Ser-Tyr-Pro-His-Ala和Ala-Glu-Gln-Tyr-Arg-Leu-Val-Gly。因主要由谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸等鲜甜味氨基酸构成，推测可能对鸡汤鲜味有贡献。