小分子糖及其类似物与α-葡萄糖苷酶的分子对接

徐晓梅，温家颖，王庆华,

（1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006；2.广东药科大学药学院，广东 广州 510006）

α-葡萄糖苷酶是人体肠道内碳水化合物消化吸收的关键酶类，它对包括糖蛋白及糖脂的形成以及碳水化合物在小肠内部的消化过程和控制体内血糖水平起着举足轻重的作用[1-2]。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制小肠黏膜刷状缘上的α-葡萄糖苷酶，能显著延缓碳水化合物向单糖的转化，降低饭后的血糖峰值[3-4]。世界卫生组织根据现今糖尿病的发病率预测大概到2025年全球可能有3亿，甚至更多的人会患糖尿病，或受到糖尿病的干扰和威胁[5]。α-葡萄糖苷酶抑制剂已经被我国糖尿病防治指南建议为一线药物，尤其适用于喜食含高碳水化合物食物的东方人群[6-7]。除此之外，该领域学者更希望能通过提倡对辅助降血糖食品的食用，用食疗的方法调节血糖水平，有效预防糖尿病。在辅助降糖保健食品中糖类及其类似物质作为重要的α-葡萄糖苷酶抑制剂之一，在降血糖方面起着十分重要的作用。

随着计算机技术的发展，计算机辅助药物设计[8]的方法已经得到广泛应用，分子对接技术是其重要的组成部分。分子对接技术[9]则是基于药物分子结构的设计过程中一个很关键的方法，它是利用空间构象和相互作用在结合位点之间不断地去定位和去寻找出最佳的匹配状态。AutoDock是美国Scripps研究所Olson实验室开发与维护的一款分子对接模拟软件，主要应用于配体-蛋白质分子对接，用来预测生物大分子和小分子配体之间的相互作用的自动化程序[10-11]。AutoDock优势在于通过快速的基于格点能量的计算方法和有效的扭转自由度搜索方法这两种方法，很好地平衡了精准计算与合理计算资源之间的矛盾，大大节省了科研人员耗费在晶体结构修饰的时间[12-14]。

本研究利用AutoDock软件对20 种小分子单糖及其类似物与α-葡萄糖苷酶进行模拟对接，探索其作用的机理，通过合理药物设计的方法结合受体与配体的相互作用规律，进一步优化改造提取物质抑制剂分子结构，以期为获取更高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

AutoDock 4.2及AutoDock Tools 1.5.6软件从官网（http://autodock.scripps.edu/）下载，α-葡萄糖苷酶的3D结构程序数据库文件（program database file，PDB）从PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载，编号为2QMJ，保存。20 种小分子结构sdf文件从Pubmed数据库下载，再通过Openbabel软件把sdf格式转换为PDB格式保存。

1.2 AutoDock 4.2软件分子对接步骤及对接参数的设置

1.2.1 配体和受体的预处理

经软件Swiss-PdbViewer 4.1分析发现2QMJ文件里的蛋白结构缺失了7 个氨基酸氨基酸残基，分别是Ser1、Ala2、Glu3、Cys4、Pro5、Val6、Gln837，补全氨基酸残基，得到完整的受体结构PDB文件。将补全氨基酸残基后的2QMJ文件导入到AutoDock中，删去2QMJ受体文件所含的NAG、GOL、ACR等基团，去水加氢，计算Gasteiger电荷，合并非极性氢原子，文件保存为2QMJ.pdbqt[15-16]。AutoDock 4.2可以选择柔性或刚性对接，但选取柔性基团的不确定因素较多，因此本实验仍采取刚性形式对接。AutoDock读入配体，合并非极性氢原子，加Gasteiger电荷，使其保持最小能量状态[17-18]，将文件保存为Acrbose.pdbqt。AutoDock Tools 1.5.4软件中的Ligand子程序包可自动检测可旋转键的个数，在对接过程中，这些键可以灵活旋转与受体分子对接。

1.2.2 配体受体对接过程

将2QMJ酶的氨基酸残基序列导入BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行分析，结果显示2QMJ的活性位点在第300～600位氨基酸残基之间，确定以第441位氨基酸残基Trp441坐标作为中心坐标，坐标值为（-21.56，-6.936，-1.971）。对接参数格点间距设置为0.375 Å，大小为60 Å×60 Å×60 Å，其大小能够保证配体完全处在酶活性中心范围内，配体构象搜索过程使用半经验打分函数与拉马克遗传算法[19]。由于本次选取的20 个小分子的柔性键不多，故算法对接的轮数设为50，在分子对接运行过程中，能量评估的最大数目，平移步骤大小及其他参数取默认值[20]。

1.3 新型小结构分子结构的构建

在Window写字板中打开所需改造小分子结构PDB的文件，将目标原子更改为新的原子字母符号，重新保存为PDB文件，即可得到新的配体分子结构的PDB文件用于对接实验。

1.4 数据统计及图表绘制

图表以Excel软件绘制，以SPSS 20.0软件统计包进行t检验统计学处理。相关小分子与酶对接的图均由AutoDock软件导出。

2 结果与分析

2.1 对接方法的准确性验证

选取临床降血糖常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶进行对接，以验证AutoDock 4.2参数设置的准确性。将2QMJ结构活性中心所结合的ACR（即阿卡波糖分子）取出作为配体，与删去了此配体的2QMJ酶重新对接。结果显示对接结合自由能最低为-7.63 kcal/mol，其均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值为1.99，小于2。一般认为RMSD值小于2，即可保证小分子配体与受体进行有效对接[21-22]。图1B为Acrbose1_1与2QMJ活性中心的对接结果，可见阿卡波糖已经成功地嵌入α-葡萄糖苷酶表面的活性中心中，说明本实验的参数设置合适，能较合理地模拟抑制剂与酶在活性中心的结合构象，对接方法可信。

图 1 阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶对接结果图Fig. 1 Molecular docking between acarbose and α-glucosidase

2.2 20 种小分子单糖及其类似物的分子对接

20 种小分子的活性数据及软件预测的最低对接结合自由能见表1。本研究所采用20 种小分子单糖及类似物对α-葡萄糖苷酶活性IC50的数据来自文献[23]。以对接结合自由能（每种配体分子选择构象最低的结合自由能）为横坐标，抑制剂pIC50为纵坐标，考察20 种小分子单糖及类似物的对接结合自由能与pIC50关系，其回归方程为：y=-0.936 2x-3.923 7，r=0.738 9。从r值看，结合自由能和pIC50具有很紧密的相关性。上述结果显示由AutoDock 4.2预测的结合自由能与实验测得的pIC50存在可以接受的相关性，从另一方面说明通过AutoDock 4.2的分子对接大致可以预测抑制剂对α-葡萄糖苷酶IC50。

表 1 20 种小分子对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及对接结合自由能Table 1 Inhibitory effects and binding free energy of 20 small molecules and their analogues against α-glucosidase

通过AutoDock和UCSF Chimera P软件[24]分析20 种小分子配体与酶对接后的复合物和α-葡萄糖苷酶之间的氢键作用。发现酶活性中心点氨基酸残基中，Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526最容易与小分子配体的H、O原子形成氢键作用，这些氨基酸残基在与小分子结合时发挥较为重要的作用，尤其以Asp542、Asp327和Asp443与小分子配体形成氢键的机会最大，这是因为Asp侧链基团为羧基，其上的两个氧原子很容易与小分子配体上的氢形成氢键。此外范得华力和静电相互作用等非键相互作用在酶活性中心与小分子配体形成稳定的结合构象中也起了非常重要的作用。图2显示了1-脱氧野尻霉素和井冈霉按与α-葡萄糖苷酶活性中心氨基酸残基之间的相互作用。

图 2 1-脱氧野尻霉素（A）和井冈霉胺（B）与α-葡萄糖苷酶对接氢键作用图Fig. 2 Hydrogen bonding of 1-deoxynojirimycin (A) and validamine (B)with α-glucosidase

2.3 假单糖分子的分子对接

在20 个小分子中，1-脱氧野尻霉素的对接结合自由能为-8.26 kcal/mol，井冈霉胺为-8.79 kcal/mol，大大低于其他化合物，说明两种化合物与酶的结合较为牢固，这与两者同属于强效α-葡萄糖苷酶抑制剂的性质一致。虽然其中的单糖分子结构与1-脱氧野尻霉素、井冈霉胺等结构相似，但这些单糖与后两者的对接结合自由能却相差很大，提示1-脱氧野尻霉素和井冈霉胺环上的N原子和C原子可能是影响对接结合自由能的重要因素。将其中的8 种单糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、海藻糖、果糖、2-脱氧-D-葡萄糖和6-脱氧-D-葡萄糖）糖环上的O原子分别替换为N原子和C原子，构建新的假单糖化合物与酶进行对接，比较每种单糖与原子替换后的N假单糖和C假单糖的结合自由能，结果见表2。

表 2 8 种单糖与假单糖分子对接结合自由能Table 2 Binding free energies of eight monosaccharides with pseudomonosaccharide molecules

单糖与N假单糖两组间对接结合自由能t检验结果：t=8.76×10-10，显示两组间结合自由能存在显著性差异，说明把单糖糖环上的O替换为N后，假单糖分子对接结合自由能减小，可见新构建的假糖分子比相应的单糖分子与酶的结合能力更强。

单糖与C假单糖两组间对接结合自由能t检验结果：t=0.34，两组间无显著差异，说明把单糖糖环上的O原子替换为C原子后，假糖分子和单糖分子的对接结合自由能的差异无意义，单糖糖环上的O原子替换为C原子不影响单糖分子与受体的结合，同时也从另一个方面显示了N原子对此类结构的化合物与酶活性中心结合的重要性。

2.4 假井冈霉胺分子对接

对接结果中井冈霉胺的结合自由能是最小的，其结构与单糖分子亦相似，差别在于侧链有—NH2和杂环内的O原子。根据这一特点，用软件设计了5 种形式改造的假井冈霉胺分子，用AutoDock分别与α-葡萄糖苷酶进行对接。井冈霉胺结构如图3所示。

图 3 井冈霉胺结构示意图Fig. 3 Chemical structure of validamine

表 3 井冈霉胺改造后的对接结合自由能Table 3 Binding free energy after modification of validamine

表3显示，化合物2、4中，不管在R1位还是R2位，只要引入N原子，对接结合自由能与井冈霉胺的结果基本一致；化合物1、3中，R1和R2位均无N原子，对接结合自由能较大，显示与酶的结合能力减弱；化合物5中，R1和R2位同时引入N原子，对接结合自由能明显变小，结合程度变得更牢固。上述结果提示，在类似的小分子结构中，N原子在与α-葡萄糖苷酶对接中起着非常重要的作用。含N原子的六元杂环结构的小分子带—NH2取代基后，能大大提高配体与受体的亲和力，其可能原因是N原子替换后，虽然这些生物电子等排体的键角和空间结构非常相近，但是电负性和疏水性不同，因此替换后会发生生物活性改变，与受体的亲和力也随之变化[25]。

3 结 论

对接结合自由能打分是AutoDock分子对接技术关于对接结果优劣的最简单、最直接的评价，对接结果给出的结合自由能越低则打分越高，打分最高构象配体与受体的结合是最牢固的结合模式[26-28]。本研究中20 种小分子化合物对接结合自由能与其抑制实验中得到的pIC50数据基本呈负相关，说明小分子与酶对接结合自由能越小，抑制效果越好。从对接结果中还发现Asp542、Asp443、His600、Asp327和Arg526易与小分子配体的H、O形成氢键，其中显示Asp542和His600对酶活性最为重要。单糖分子改造后的结果显示是N原子的存在使得氢键更易产生，大大增强了配体与受体的结合和稳定程度。对井冈霉胺分子进行5 种形式改造后，当分子结构环内引入N原子或有NH2取代基时，对接结合自由能明显变小，结合程度变得更强。以往也有研究人员在酶活性抑制实验中发现很多胺类物质是许多糖苷酶的抑制剂，并认为碱性糖衍生物（特别是糖胺）比相应的中性类似物具有更强的抑制葡萄糖苷酶活性的能力[23]，岳保珍等[29]发现3 种氮杂糖对α-或β-葡萄糖苷酶呈现竞争性抑制。虽然本研究所构建的假单糖或假井冈霉胺分子不一定存在，但研究结果显示N原子在α-葡萄糖苷酶抑制剂设计中具有很重要的意义，未来可以更多关注含N杂环结构的化合物，提取或合成此类具有更强活性的α-葡萄糖糖苷酶抑制剂。

相较于单纯纯化学合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂，天然来源的具有绿色、安全、毒副作用小等特点。然而植物来源α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究也存在一定局限性，目前研究着重于分离和提取单体化合物并利用体外酶活性筛选模型筛选活性单体，但在天然活性化合物的药物化学、药理学及临床研究方面尚有欠缺[21,30]。本研究借助AutoDock软件对20 种小分子单糖及其类似物与α-葡萄糖苷酶进行模拟对接研究，探索其作用的机理，以便通过合理药物设计的方法结合受体与配体的相互作用规律，进一步优化改造提取的抑制剂分子结构，为更高效葡萄糖苷酶抑制剂的获取提供了新思路。