金柑多酚提取与抗氧化活性分析

史文景，游双红， 胡佳羽， 江 铭， 王 昱， 缪伊雯，邓 鑫， 罗 明， 陈 宇

（1.重庆市农业科学院 果树研究所，重庆 401329；2.长江师范学院 生命科学与技术学院，重庆 408100）

金柑 （Fortunella japonica（Thunb） Swingle） 又称金橘、金枣，属芸香科金柑属植物，原产于我国华南地区。金柑果实体积小，形状呈椭圆形，果肉和果皮能够同时食用，味道酸甜，富含维C、芳香油、类胡萝卜素、类黄酮、柠檬苦素等多种活性物质[1]，以及铁、钙、钾、钠、锌、铜、硒等矿质物元素[2]，营养价值极高。多酚是一类酚羟基类及其衍生物的总称，存在于多种水果中，是源于丙氨酸代谢途径和莽草酸代谢途径的重要次生代谢产物，对于植株摄取营养、合成蛋白质、进行光合作用等多种生理活动有着重要意义，因其具有很强的抗氧化作用而被称为“第七大营养素”[3]。丰富的多酚类物质使金柑有很高的药理价值，如抗氧化、抑菌、抗癌、调节免疫、降血脂和防治心脑血管疾病等功效[4]。植物多酚具有广阔的应用前景，已成为食品和药品开发领域的热点，其提取方法有溶剂萃取法[5]、超声波提取法[6]、酶法辅助提取[7]、微波提取法[8]和超临界流体提取法[9]等，抗氧化活性分析方法主要有DPPH自由基清除法[10]、ABTS自由基清除法[11]、铁离子抗氧化能力法[12]等。当前，对于金柑多酚的提取研究多集中于一种萃取溶剂，没有对不同萃取溶剂的提取效果进行对比分析，试验通过分析不同萃取溶剂对金柑多酚的提取效果及抗氧化活性影响，为金柑多酚提取方法优化及合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：金柑。

试剂：抗坏血酸标准品（色谱纯）、没食子酸标准品 （色谱纯）、芦丁标准品 （色谱纯）、DPPH（2,2-diphenyl-1-pricrylhydrazyl radical） ， 2,2'-azinobis（ 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ ABTS）和 TPTZ[2,4,6-tris（ 2-pyridyl）-s-triazine]， 上海源叶生物科技有限公司提供；其他试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-8型数显恒温水浴锅，金坛市荣华仪器制造有限公司产品；PT-3502C型全波长酶标分析仪，北京普天新桥技术有限责任公司产品；SB-5200BD7D型超声波清洗仪，宁波新芒生物科技有限公司产品；FW-100型高速万能粉碎机、FW-100型电热鼓风干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司产品；JA50型电子分析天平，常州市幸运电子设备有限公司产品；TGC-16B型离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 金柑的预处理

将金柑切薄片，于70℃烘箱中烘干至恒质量，粉碎，过80目筛，粉末收集于自封袋中，存储于干燥器中备用。

1.3.2 金柑多酚提取工艺流程

准确称取经预处理后的金柑粉100 g（准确至0.1 g），与提取剂混合（料液比1∶15），超声提取（70 ℃，40 min） ， 离心 （10 000 r/min，15 min） ， 取上清液，减压浓缩得到甲醇提取物浸膏。将浸膏溶解于200 mL蒸馏水，分别采用200 mL萃取剂（正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、异戊醇） 进行萃取，重复萃取3次，减压浓缩得到提取物浸膏，然后用甲醇溶解、离心后取上清液，分别测定多酚、类黄酮含量和抗氧化活性[13]。

1.3.3 多酚含量测定

参照谭飔等人[14]方法，选取不同浓度没食子酸标准溶液和样品50 μL于96孔板中，然后分别加入福林酚试剂10 μL，充分混合并避光反应6 min，加入质量分数7%Na2CO3溶液100 μL和去离子水80 μL，充分混合后避光90 min，于波长760 nm处测定其吸光度，重复3次。以没食子酸浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线，多酚含量以没食子酸含量表示。

1.3.4 总黄酮的测定

参照谭飔等人[14]方法，以芦丁为标准品测定总黄酮含量。取不同浓度梯度的芦丁标准溶液和样品10 μL加入96孔板中，加入质量分数5%NaNO2溶液10 μL，混合后在室温下静置6 min，然后加入质量分数4%NaOH溶液100 μL和体积分数60%乙醇溶液120 μL，混匀后室温反应15 min，于波长510 nm处测定其吸光度，3次重复。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，黄酮含量以芦丁当量来表示。

1.3.5 抗氧化活性测定

（1） DPPH法。取样品溶液和一定浓度梯度的抗坏血酸标准溶液100 μL于96孔板中，加入0.5 mmol/L的DPPH溶液100 μL，混匀后放置30 min，于波长517 nm处测定吸光度，3次重复。以自由基清除率作为纵坐标，抗坏血酸浓度作为横坐标制作标准曲线，用每克样品中抗坏血酸含量（mg/g）来表示样品结果。

式中：A0——空白的吸光度；

A1——100 μL抗坏血酸溶液+100 μL DPPH溶液的吸光度。

（2） ABTS法。 将7 mmol/L ABTS+溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液（体积比1∶1） 混合均匀，于室温下过夜静置得ABTS+溶液，利用无水乙醇进行稀释，使其吸光度稳定在0.7±0.02。取样品溶液和不同浓度梯度的抗坏血酸标准溶液100 μL于96孔板中，加入ABTS+溶液100 μL，混匀后反应10 min，于波长734 nm处测定吸光度，重复3次。以自由基清除率作为纵坐标，抗坏血酸浓度作为横坐标制作标准曲线，以每克样品干样中抗坏血酸含量（mg/g）来表示样品结果。

式中：A0——空白的吸光度；

A1——100 μL抗坏血酸溶液+100 μL ABTS+溶液的吸光度。

（3） 铁离子抗氧化能力（FRAP） 法。取样品溶液和不同浓度梯度的抗坏血酸溶液20 μL于96孔板中，加入FRAP溶液 100 μL混合，加入蒸馏水100 μL，充分混合后于37℃下水浴10 min，于波长593 nm处测定吸光度，3次重复。以吸光度作为纵坐标，抗坏血酸浓度为作为横坐标制作标准曲线，以每克样品干样中抗坏血酸含量（mg/g） 来表示样品结果。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

总酚、总黄酮及3种抗氧化活性检测方法的线性范围、线性方程和相关系数（R2） 见表1。

表1 总酚、总黄酮及3种抗氧化活性检测方法的线性范围、线性方程和相关系数 （R2）

各标准曲线分别在 0～120 μg/mL， 0～1 500 μg/mL，0～60 μg/mL， 0～120 μg/mL， 0～120 μg/mL 线性范围内，相关系数（R2）均不小于0.980 8，线性关系良好。

2.2 不同提取剂对金柑多酚提取效果的影响

萃取物中总酚含量比较见图1。

如图1所示，不同极性溶剂对金柑多酚提取效果影响较大，各萃取物总酚的含量顺序为正丁醇相＞乙酸乙酯相＞异戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑多酚的含量最高，为4.128 mg/g，而石油醚相多酚含量最低，仅有0.421 mg/g。根据赵谋明等人[15]研究发现，梨全果中的酚类物质含量为0.272～0.407 mg/g，柑橘总酚含量为0.406～1.694 mg/g，可以看出金柑多酚含量高于梨和柑橘的多酚含量。

2.3 不同提取剂对金柑总黄酮提取效果的影响

萃取物中总黄酮量比较见图2。

如图2所示，不同极性溶剂对金柑总黄酮提取效果影响较大。各萃取物总黄酮的含量顺序为正丁醇相＞乙酸乙酯相＞异戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑总黄酮的含量最高，为2.073 mg/g，而石油醚相的总黄酮含量最低，仅有0.206 mg/g。

2.4 不同溶剂萃取物抗氧化活性测定

2.4.1 DPPH自由基清除法

DPPH法检测金柑不同极性萃取物的抗氧化活性见图3。

如图3所示，不同极性溶剂萃取金柑对DPPH自由基清除的影响较大，各萃取物的对DPPH自由基清除顺序为正丁醇相＞乙酸乙酯相＞异戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑抗氧化活性最好，每克样品干样中抗坏血酸含量达到3.058 mg/g，而石油醚相金柑抗氧化活性最低，每克样品干样中抗坏血酸含量仅有0.479 mg/g。

2.4.2 ABTS自由基清除法

ABTS法检测金柑不同极性萃取物的抗氧化活性见图4。

如图4所示，不同极性溶剂萃取金柑对ABTS自由基清除的顺序为正丁醇相＞乙酸乙酯相＞异戊醇相＞石油醚相。其中，正丁醇相金柑抗氧化活性最好，每1 g样品干样中抗坏血酸含量达到3.058 mg/g，而石油醚相的金柑抗氧化活性最低，每1 g样品干样中抗坏血酸含量仅有0.479 mg/g。

2.4.3 FRAP法

FRAP法检测金柑不同极性萃取物的抗氧化活性见图5。

如图5所示，不同极性溶剂萃取对金柑多酚还原能力影响较大，顺序为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞异戊醇相＞石油醚相。其中，乙酸乙酯相金柑还原能力最好，每1 g样品干样中抗坏血酸含量达到5.100 mg/g，而石油醚相的还原能力最低，每1 g样品干样中抗坏血酸含量仅有0.231 mg/g。

综上，金柑多酚提取物具有良好的抗氧活性，不同的抗氧化测定方法所得结果有所不同，DPPH法和ABTS法中抗氧化活性最好的是正丁醇相，而在FRAP法检测中抗氧化活性最好的是乙酸乙酯相，造成这种差异的原因可能是不同萃取部位金柑多酚的组成成分不同。此外，多酚和黄酮含量越高其抗氧化活性也越好，表明多酚、类黄酮与抗氧化活性之间有良好的相关性。类似结果范祺等人[16]也有相关报道，表明葡萄中多酚、黄酮含量较高的品种，其抗氧化活性也较强。

3 结论

以金柑为原料，探究不同萃取剂种类对金柑提取物多酚提取效果的影响。结果表明，不同极性部位的总多酚和总黄酮含量差别较大，正丁醇相金柑总酚和总黄酮含量均最高，分别为4.128 mg/g和2.073 mg/g；以DPPH和ABTS自由基清除法分别测定不同金柑萃取物的自由基清除能力，结果表明正丁醇相金柑的抗氧化能力最强；而以FRAP法测定不同金柑萃取物的抗氧化活性，结果表明，乙酸乙酯相金柑的抗氧化能力最强。金柑萃取物抗氧化能力与金柑多酚含量有一定关系。