三阴性乳腺癌细胞膜表面EGFR和c-Met的单分子水平共定位研究

柴彬彬，王丽，李劲涛，张晓菲，夏阳，吉元，盛望，韩晓东

北京工业大学 a.生命科学与生物工程学院；b.固体微结构与性能研究所；北京 100124

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，已成为癌症致死的第二大病因[1]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC），是指孕激素受体（PR）、雌激素受体（ER）、人表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性的浸润性乳腺癌，占所有乳腺癌病例的10%～20%，与非TNBC 相比其恶性程度更高[2]。由于缺乏有效的靶向治疗，TNBC 患者的预后普遍较差[3]。因此，寻找TNBC 治疗靶点和治疗方式是当前的研究热点。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶受体ErbB 家族的4个成员之一，是一种跨膜糖蛋白。EGFR 通过多种机制异常激活，包括受体过度表达、突变、配体依赖性受体二聚化、配体非依赖性激活等，并且与多种人类癌症的发生有关[4]。EGFR 与配体表皮生长因子（EGF）结合后形成二聚体，诱导其自身磷酸化，从而启动下游信号通路，促进细胞增殖，抑制凋亡和促进细胞侵袭[5]。

间质表皮转化因子（cellular mesenchymal-ep⁃ithelial transition factor，c-Met）即肝细胞生长因子受体，是由原癌基因c-met 编码的受体酪氨酸激酶，属于RON 亚族，与配体肝细胞生长因子（he⁃patocyte growth factor，HGF）具有高度结合性[6]。配体与c-Met 在胞外区结合后，诱导c-Met 磷酸化，激活多种细胞内信号传导途径，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[7]。c-Met 通路的失调在胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌等多种人类癌症中均有报道。

EGFR 和 c-Met 在 TNBC 中 的 异常 高表 达 ，使之成为受关注的治疗TNBC 的重要药物靶点。有研究利用免疫共沉淀的方法，鉴定了EGFR/c-Met复合物的存在[8]，但尚未对它们的聚合形式进行细胞学直观验证。

结合已有经验，我们在三阴性乳腺癌细胞中用EGFR 和c-Met 特异的核酸适配体介导链接纳米金颗粒，采用扫描电子显微镜的单分子成像技术，在纳米尺度对EGFR 和c-Met 在细胞膜表面的表达数量及聚集状态及二者共定位关系进行了表征，探究了EGFR 和c-Met 的共定位关系及相互作用机制，为更清晰地了解蛋白功能及调控机制提供了新的可视化研究手段，也为药物研发和开展精准靶向治疗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

三阴性乳腺癌MB-231 细胞系购于美国ATCC；链霉亲和素修饰的纳米金颗粒（10 和30 nm）由NANOCS 公司合成；特异性结合EGFR 的核酸 适 配 体 TuTu22（5′-TGCCGTTTCTTCTCTTTCGC TTTTTTTGCTTTTGAGCATG-3′）[9]和特异性结合 c-Met 的 核酸适配体 SL1（5′-ATCAGGCTGGATGGT AGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGAT-3′）[10]由生工生物工程股份有限公司合成；ITO 导电玻璃购于上海聚笛玻璃公司。

1.2 MB-231细胞培养

在生物安全柜中将ITO 玻璃置于75%酒精中浸泡10 min，紫外灯照射30 min 后放入24 孔板中，接种 3×104/孔 MB-231 细胞，培养 24 h 后每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞30 min，加入PBS 反复洗涤ITO 玻璃5 次，晾干后备用。

1.2.1 单一标记 将20 nmol/L 生物素标记的c-Met 配体室温敷育在ITO 导电玻璃上，于湿盒中敷育2 h，用超纯水清洗干净，晾干后将链霉亲和素标记的金颗粒（30 nm）超纯水稀释至1/10，滴在细胞上，湿盒中敷育2 h，超纯水清洗ITO 导电玻璃5 次后洗净，晾干待测。用同样方法在别组ITO 导电玻璃以30 nm 的金颗粒标记EGFR，超纯水反复冲洗后晾干。

1.2.2 共同标记 以上述方法用纳米金颗粒（30 nm）单一标记c-Met 后，用同样方法继续在本组ITO 导电玻璃上以10 nm 的金颗粒标记EGFR，超纯水反复冲洗后晾干。

1.3 扫描电镜表征

实验设备为FEI 公司的Quanta 600 环境扫描电镜（ESEM），采用二次电子（SE）探头和背散射电子（BSE）信号成像，加速电压10～20 kV，放大倍率500～200 000。

1.4 统计分析

用imageJ 软件随机选择细胞不同位置的照片5 张进行分析统计。分别统计2 种膜蛋白的单体、二聚体、多聚体数量及比值，分析异源二聚体和多聚体的形态并计算比例。

2 结果

2.1 MB-231细胞表面EGFR、c-Met单分子成像

图1 是三阴性乳腺癌MB-231 细胞在不同倍数下的背散射电子像。图1A 为1400 倍镜下拍摄的细胞群照片，MB-231 细胞能够平整分散地在ITO 导电玻璃上自然生长，可以开展高分辨成像研究。图1B、C 清晰展现了50 000 倍镜下局部细胞膜表面的单分子成像，细胞膜上存在大量30 nm 金颗粒偶联的 EGFR 和 c-Met，背景清晰，可以进行统计分析。

2.2 MB-231细胞表面EGFR、c-Met单分子聚合形态观察

图1 纳米金颗粒（30 nm）标定EGFR、c-Met 在扫描电镜下的细胞和单分子成像

图2 纳米金颗粒（30 nm）标定EGFR、c-Met 在扫描电镜下的单分子成像

图2 是三阴性乳腺癌MB-231 细胞膜表面EGFR、c-Met 在50 000 倍镜下的背散射电子像。由于一个膜蛋白只能连接一个纳米金颗粒，即图中每一个金颗粒代表一个膜蛋白，因此纳米金颗粒的聚集状态实际反映了膜蛋白的聚合形态。图2C 是EGFR、c-Met 表达的定量统计直方图。经计算，EGFR 单体、二聚体、多聚体的占比分别为48.60%、29.83%、21.57%，c-Met 单体、二聚体、多聚体的占比分别为38.24%、27.66%、34.10%。总体来说，在正常状态下，EGFR 和c-Met 主要存在形式为包括二聚体在内的多聚体，这与前期研究结果相同，因此，我们将继续利用这一方法共同标记2 种蛋白。

2.3 MB-231细胞表面EGFR、c-Met形成异源二聚体和多聚体

图3 是三阴性乳腺癌MB-231 细胞膜表面EGFR 和c-Met 在100 000 倍镜下的背散射电子像。利用10 和30 nm 的金颗粒对细胞膜表面的EGFR、c-Met 进行共定位，图片清晰地展示了在正常状态下，细胞膜表面不仅存在EGFR、c-Met各自的单体、同源二聚体和多聚体，二者还能结合形成异源二聚体和异源多聚体。图3B 是EGFR和c-Met 表达的定量统计直方图。经计算，EGFR和c-Met 单体、二聚体、多聚体所占比例分别为50.15%、25.57%和24.28%。其中，异源二聚体占二聚体总数的13.71%，异源多聚体占多聚体总数的24.42%。该结果证实了EGFR、c-Met 异源二聚体和多聚体的存在，也预示着这2 种膜蛋白可能存在结构和功能上的相互作用，共同协同调控下游通路。

3 讨论

在三阴性乳腺癌细胞中，EGFR 和c-Met 同时过表达。它们激活促进细胞生长、侵袭和转移的多种信号传导途径，主要包括Ras/ERK 和PI3K/AKT 途径。当前，能够抑制 EGFR 和 c-Met 通路的分子靶向药物主要有单克隆抗体和单靶点或多靶点的酪氨酸激酶抑制剂。Cetuximab 和Panitu⁃mumab 等单克隆抗体特异性结合EGFR 的胞外域，Gefitinib、Erlotinib 等小分子抑制剂结合在胞内酪氨酸激酶域上的ATP 位点。但大量临床数据表明，随着时间的推移，EGFR 治疗存在耐药性。

同样地，HGF 或c-Met 的单克隆抗体能够防止HGF 与受体连接、受体二聚化，并诱导降解c-Met[11]。c-Met 的酪氨酸激酶抑制剂，例如Crizo⁃tinib 和 Cabozanix 已被美国 FDA 批准上市[12]，Cap⁃matinib、AMG337 等特异性更强的小分子抑制剂也处于临床研究阶段。

研究表明，c-Met 可能是导致EGFR 酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的关键因素[13]。基于此，有研究选定EGFR 和c-Met 的抑制剂Lapatinib 和Foretinib 在 TNBC 的 MB-231 细胞系中进行协同治疗，弥补了单一疗法的不足，提高了治疗效率[14]。我们的研究确定了二者异源聚合现象的存在，我们认为针对TNBC 的一种新的潜在治疗方法是联合靶向 EGFR 和 c-Met。

总之，本研究验证了在三阴性乳腺癌细胞膜表面EGFR 和c-Met 会形成异源二聚体和多聚体，明确了其占据一定的比例。结合2 种膜蛋白的结构和功能特性研究，我们推测2 个蛋白的功能发挥有一定的相关性。这将在后续研究中得到证实，并进一步揭示EGFR 和c-Met 在肿瘤发生发展中的功能、调控机制及相互作用关系，为开展精准靶向治疗提供新的科研手段。

图3 纳米金颗粒标定EGFR（10 nm）和c-Met（30 nm）在扫描电镜下的共定位成像