广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因遗传多态性*

何天文，黄演林，丁红珂，张彦，张艳霞，姚翠泽，杜丽，尹爱华

(1.广东省妇幼保健院医学遗传中心，广州 511442；2.广东省妇幼代谢与遗传病重点实验室，广州 511442)

叶酸作为一种水溶性B族维生素，在DNA合成、甲基化和基因表达等方面发挥重要作用，是机体细胞生长和繁殖必需的物质。研究发现，叶酸对孕妇尤其重要，孕妇缺乏叶酸可增加胎儿患神经管发育缺陷、唐氏综合征、泌尿系统系统畸形、唇腭裂、肛门闭锁、先天性心脏病等出生缺陷的风险[1-4]。叶酸被吸收进入体内后在肝脏二氢叶酸还原酶作用下生成具有活性的四氢叶酸而发挥作用。人体叶酸缺乏主要由补充不足和利用障碍2个方面引起的，其中，叶酸代谢酶功能异常可导致叶酸利用障碍，从而引起叶酸缺乏。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolic acid reductase，MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶之一，MTHFR基因多态性也成为近年来的研究热点之一。MTHFR基因存在多个基因多态性位点，其中MTHFR基因C677T、A1298C是最常见的突变位点，可影响编码MTHFR蛋白的活性，进而影响叶酸代谢和利用能力[5-6]。本研究旨在分析广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点多态性分布情况，以期为广东地区汉族育龄妇女补充叶酸提供实验依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2016年1月至2018年7月就诊于广东省妇幼保健院妇科、产科、生殖健康科和医学遗传中心且进行婚前检查、孕前检查、产前检查和不孕不育治疗的广东地区汉族育龄女性13 336例，年龄(29.4±4.8)岁，中位年龄29.0岁，排除患有遗传疾病或其他机体异常者。

1.2主要仪器与试剂 MICROLAB STAR全自动核酸提取工作站(瑞士Hamilton公司)；5430台式离心机(德国Eppendorf公司)；ViiA 7 Dx荧光定量PCR仪(美国Life Technologies公司)。Magen核酸提取试剂盒(广州美基生物公司)；Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂(日本TaKaRa公司)；MGB探针(上海铂尚生物技术公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 于初次就诊时采集各研究对象外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝，样本置于4～8 ℃保存，1周内完成检测。

1.3.2DNA提取 取200 μL EDTA-K2抗凝外周血，采用MICROLAB STAR全自动核酸提取工作站及Magen核酸提取试剂盒提取外周血基因组DNA。均严格按照仪器及试剂盒说明书操作。样本置于-20 ℃保存。

1.3.3基因多态性检测 使用Primer Premier 5.0软件设计引物序列和探针序列，并由北京六合华大基因科技公司合成，以FAM、HEX、ROX、CY5荧光基团标记探针。MTHFR1298上游引物序列(F)：5′-CTCTTCTACCTGAAGAGCAAGTCC-3′，下游引物序列(R)：5′-CACTCCAGCATCACTCACTTTGT-3′；MTHFR677上游引物序列(F)：5′-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3′，下游引物序列(R)：5′-CGGTGCATGCCTTCACAA-3′。PCR反应体系总体积为20 μL，包括2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10 μL、4条上、下游引物2 μL(各0.5 μL)、4条探针3.2 μL(各0.8 μL)、双蒸水3.3 μL和DNA模板2 μL。使用ViiA 7 Dx荧光定量PCR仪进行PCR反应。PCR循环参数：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s、58 ℃退火20 s、65 ℃延伸45 s，40个循环，每个循环延伸后采集荧光。采用ViiA 7 Software v1.2.1分析软件确定各个样本的MTHFR基因C677T、A1298C位点的基因型。

1.4统计学分析 采用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行数据分析。资料采用频数/构成比进行统计描述。用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验该人群的分布，MTHFR基因C677T、A1298C 2个位点分型频率及等位基因频率的组间比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1广东地区汉族育龄妇女人群MTHFR基因型频率和等位基因频率比较结果 统计广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点的基因型数据并进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果表明，MTHFR基因C677T、A1298C位点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)。

此外，广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T位点中，野生型(CC)、杂合突变型(CT)和纯合突变型(TT)分别占51.5%、38.7%和9.8%，突变T基因频率为29.2%；MTHFR基因A1298C位点中，野生型(AA)、杂合突变型(AC)和纯合突变型(CC)分别占59.3%、35.2%和5.5%，突变T基因频率为23.1%。MTHFR基因C677T、A1298C位点基因型分布和等位基因频率分布与全国人群以及江苏、九江、齐齐哈尔、长沙等地区报道的结果均存在一定的分布差异(P均<0.05)。见表1和表2。

表1 广东地区与全国及其他地区MTHFR基因型频率比较[n(%)]

注：a，与广东地区比较，P<0.05。

表2 广东地区与全国及其他地区MTHFR基因C677T、A1298C位点等位基因频率比较[n(%)]

注：a，与广东地区比较，P<0.05。

2.2千人基因组数据库中不同人群等位基因频率比较 经千人基因组数据库(https://www.internationalgenome.org/)查询发现，本研究中广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点的等位基因频率与非洲、欧洲、南亚和美洲地区人群等位基因频率的分布存在不同程度的差异(P<0.05)，而与东亚人群等位基因频率的分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 与千人基因组数据库中不同人群等位基因频率比较[n(%)]

注：a，与广东地区比较，P<0.05。

3 讨论

MTHFR是叶酸-甲硫氨酸代谢途径中的关键酶之一，可将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。MTHFR基因存在多种基因多态性位点，其中C677T、A1298C是最常见的突变位点，可影响编码的MTHFR蛋白的活性，进而影响叶酸代谢和利用能力[12]。本研究采集广东地区汉族育龄女性13 336例样本，发现MTHFR基因C677T位点中杂合突变型(CT)和纯合突变型(TT)分别占38.7%和9.8%，突变T基因频率为29.2%，结果较贺宪民等[7]报道的中国人群相比均降低；MTHFR基因A1298C位点中杂合突变型(AC)和纯合突变型(CC)分别占35.2%和5.5%，突变T基因频率为23.1%，比贺宪民等[7]报道的中国人群均升高。MTHFR基因C677T、A1298C位点基因型分布和等位基因频率分布与贺宪民等[7]报道的中国人群比较差异均有统计学意义。而孟宏霞等[14]报道在广东省江门地区MTHFR基因C677T位点基因型分布和等位基因频率与贺宪民等[7]报道的中国人群比较情况相一致，但是其报道的MTHFR基因A1298C位点基因型分布和等位基因频率分布与贺宪民等[7]中国人群比较结果不一致，分析原因可能与选择的地区人群和样本量有关。

广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点的基因型和等位基因数据与我国其他已经报道的地区汉族育龄妇女比较发现，广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点的基因频率和等位基因频率与江苏[8]、九江[9]、齐齐哈尔[10]和长沙[11]等地区汉族育龄妇女人群相比存在一定的差异。广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T位点的纯合突变型(TT)频率和突变T基因频率比江苏[8]、九江[9]、齐齐哈尔[10]和长沙[11]等地区汉族育龄妇女人群均降低。广东地区育龄妇女MTHFR基因A1298C位点的纯合突变型(CC)频率和突变C基因频率与江苏[8]、九江[9]、齐齐哈尔[10]和长沙[11]等地区汉族育龄妇女人群相比均升高。本研究和其他研究结果均表明，MTHFRC677T、A1298C位点的多态性分布存在地区差异[14-18]。这种地区差异可能与选择的地区人群和样本量有关。广东地区的人群主要以汉族人群为主，与其他民族人群可能存在一定的遗传异质性；此外，南方人群和北方人群由于长期生活的环境不同，也可能存在一定的遗传差异；本次研究纳入的样本量与其他研究的样本量存在较大的差异，也可能是引起分析结果不一致的一个辅助性因素。另外，通过对千人基因组数据库查询发现，本研究中广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点的等位基因频率与非洲、欧洲、南亚和美洲地区人群等位基因频率的分布存在不同程度的差异，与东亚人群等位基因频率的分布差异无统计学意义。综上所述，本研究分析了广东地区汉族育龄妇女MTHFR基因C677T、A1298C位点多态性分布情况，为广东地区汉族育龄妇女补充叶酸提供了科学依据。