体外模拟胃肠消化过程中四种茶叶活性成分及抗氧化性变化规律

刘静敏,史静兰,鲁 江,徐 歆,李 倩,陈小强

(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉 430068)

紫娟是云南大叶群体茶树品种中的一个变异品种,其芽、叶、茎都为紫色[8]。有研究表明,紫鹃茶的原花青素含量很高,具有极强的抗氧化能力[9-10]。中黄一号在春季发芽时新梢嫩叶叶色有可逆性黄化现象,相较于一般绿茶具有更高含量的氨基酸[11],且由于其形态特征的特异性、制茶品质的优异性和较强的适应性,产品供不应求,经济效应显著。白叶一号是安吉白茶的一个茶树品种,其特异性主要表现在春季发芽时新梢嫩叶叶色的可逆性白化现象,在白化过程中新梢的叶绿素含量急剧下降,氨基酸含量明显上升[12]。福鼎大白茶作为传统茶叶的一个代表,同时也是全国茶叶区试标准对照种,种植面积最广[13]。

Green等[14]对绿茶进行体外模拟胃肠消化,采用高效液相色谱法对消化前后的儿茶素进行评估,结果发现,饮茶习惯可能影响儿茶素的消化,并可能导致不同的生理特征。Tenore等[15]将同一茶树品种采用不同加工方式生产的白茶、绿茶与红茶,通过模拟胃肠消化、肠道渗透和血浆蛋白相互作用对比三种茶叶中儿茶素的变化发现,白茶中儿茶素在口服条件下具有良好的稳定性,具有最好的肠道生物可接受性和生物利用度,并可能在调节血糖和血浆胆固醇方面发挥重要作用。目前对茶叶活性成分多酚类物质在消化过程中的含量及抗氧化性变化规律的研究主要集中在儿茶素,而尚未发现对茶叶中黄酮、原花青素类物质的相关报道。

为总结茶叶中多酚类物质及其抗氧化活性变化规律，本文采用紫娟、中黄一号、白叶一号和福鼎大白作为研究对象,用体外模拟胃肠消化的方法,测定四种茶叶的多酚、黄酮、原花青素的含量和总结变化规律,以及分析消化过程对抗氧化活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫娟、中黄一号、白叶一号、福鼎大白 江苏省茶叶研究所玉山基地提供(江苏宜兴),于2018年4月份手工采摘,采摘标准为一芽二叶,并通过在120 ℃下烘干半小时处理获得成品,粉碎(过60 目)于4 ℃保存;香草醛、浓盐酸、乙醇 百灵威科技有限公司;儿茶素标准品 南京狄尔格医药科技有限公司;氯化钠、甲醇、胆盐3号、碳酸钠、Folin-酚试剂、硝酸铝、乙酸钾 国药集团化学试剂有限公司;胃蛋白酶(456 U/mg)、胰蛋白酶(100～500 U/mg)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

T6型新世纪紫外光分光光度计 尤尼科仪器有限公司;DK-S22型恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;RJ-TLT-16G离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司;GZX-9140 MBE电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司;ME104E/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SHB-Ш循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;Multiskan FC酶标仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;KQ-300E超声波清洗机 上海之信仪器有限公司;JYL-CO2OE九阳料理机 九阳有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶汤提取 根据传统饮茶习惯,分别称取4种茶粉(紫娟、中黄一号、白叶一号和福鼎大白)10 g,置于500 mL 90 ℃水中,持续搅拌5 min,然后将茶汤过滤并冷却,各茶汤定容至500 mL。

1.2.2 模拟体外消化 为了研究茶汤中活性成分及抗氧化变化规律,将1.2.1方法提取得到的茶汤溶液300 mL置于500 mL的锥形瓶中,用盐酸调节pH至2.0,加入0.6 g NaCl,然后加入0.378 g胃蛋白酶,用保鲜膜封口后,再将锥形瓶置于37 ℃水浴中振荡2 h。模拟胃部消化结束后,用氢氧化钠溶液调节消化液pH至7.0,然后加入20 mg的胰蛋白酶和125 mg的胆盐,然后在相同水浴条件下反应2 h。胃肠消化期间每隔30 min取一次样,将取出的各消化液于90 ℃条件下加热1 min,使消化酶失活,6000 r/min,离心6.5 min后,取上清液在4 ℃条件下储存备用[6,16]。

1.2.3 总多酚含量的测定 Folin-酚试剂比色法[17]测定总多酚,以没食子酸为标准品。分别移取四种茶叶样品各阶段消化液1 mL于试管中,在每个试管中分别加入5 mL 10%的Folin-酚试剂,混合后在3～8 min内再加入4 mL 7.5%的Na2CO3溶液。摇匀后在室温条件下避光放置1 h后,于765 nm波长处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标,没食子酸工作液的吸光度为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为y=0.0097x+0.0043,R2=0.9999。

鳗鱼带肉骨→预处理→净鳗鱼带肉骨→烘干→干鳗鱼带肉骨→粉碎、均质→鳗鱼肉骨粉→水提→鳗鱼肉骨粉料液→酶解→酶解液→均质→喷雾干燥→成品。

1.2.4 总黄酮含量的测定 根据Zielinski等[18]Al(NO3)3-CH3COOK显色法测定总黄酮,分别移取四种茶叶样品各阶段消化液1 mL于试管中,先加入1 mL 10%的硝酸铝溶液,再加1 mL 0.98%的醋酸钾溶液。摇匀后在室温条件下避光放置1 h,于415 nm波长处测定吸光度。以儿茶素浓度为横坐标,儿茶素工作液的吸光度为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为y=0.527x+0.0082,R2=1。

1.2.5 原花青素含量的测定 香草醛-甲醇-盐酸显色法测定原花青素[19],分别移取四种茶叶样品各阶段消化液0.5 mL于试管中,先加入2.5 mL 1%的香草醛-甲醇溶液,再加入2.5 mL 30%的盐酸溶液,用上述方法蒸馏水代替样品制备空白试样,摇匀后在室温条件下避光放置1 h,于500 nm波长处测定吸光度。以儿茶素浓度为横坐标,儿茶素工作液的吸光度为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为y=1.0284x+0.0073，R2=1。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的测定 根据Ksouri等[20]、Chang等[21]的方法进行测定,稍作改动。取4 mL 7 mmol/L ABTS原液,加入88 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液,混合均匀后暗处静置12～16 h,0 ℃保存备用。将ABTS溶液用无水乙醇稀释,使其在734 nm处吸光值为0.70±0.02,得到ABTS工作液。准确移取3 μL不同质量浓度(100～400 μg/mL)的样品液与237 μL ABTS工作液混合,于室温下避光反应30 min,测定反应液在734 nm处的吸光值,以无水乙醇作为空白,平行测定3次,取其平均值,并用0.5 mg VC/mL溶液作对照。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的测定 测定方法参考Gorjanovic等[22]的方法,稍作改动。将10 μL不同质量浓度(100～400 μg/mL)的样品液与100 μL 0.1 mmol/L甲醇-DPPH自由基充分混匀后,置于避光处反应30 min,在517 nm处测定吸光值,以甲醇作为空白,平行测定3次,取其平均值,并用0.5 mg VC/mL溶液作对照。

1.3 数据处理

以上实验均平行进行3次,得到的数据经OriginPro-9软件处理,采用Dunnett’st检验进行显著性差异分析,以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 活性成分含量分析

4种茶叶提取液中多酚、黄酮及原花青素含量见表1。消化前茶叶提取液中酚类物质含量范围为2.03(白叶一号)～2.32 mg GAE/mL(福鼎大白)。总黄酮含量范围为2.41(紫娟)～3.41 mg GA/mL(福鼎大白),其中多酚及总黄酮含量福鼎大白茶最高。原花青素含量范围为0.16(中黄一号)～0.78 mg GA/mL(紫鹃),其中紫娟茶叶提取液中原花青素含量显著高于其他茶叶提取液含量(P<0.05)。金孝芳等[23]研究认为中黄一号原花青素含量略低于其他茶叶品种,与本次实验趋势相似。吕海鹏等[24]推测紫娟茶中原花青素含量丰富,也与本研究变化一致。然而紫娟多酚含量较其他文献所述含量偏低可能是由于地区差异所导致[25]。

表1 4种茶叶提取液抗氧化活性成分含量Table 1 Antioxidant active ingredients content in 4 kinds of tea soup

注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 模拟体外消化过程中活性物质含量及抗氧化能力变化分析

2.2.1 体外模拟消化过程中多酚变化规律 4种茶叶提取液在模拟胃、肠消化过程中多酚变化如图1所示。经过胃消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号多酚含量分别下降7.27%、6.36%、16.95%、16.76%。再经过肠消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号多酚含量较原始茶叶提取液分别下降12.59%、13.44%、14.73%、13.30%。

图1 4种茶叶提取液在模拟胃、 肠消化过程中多酚含量变化Fig.1 Changes of polyphenols in four kinds of tea soup during simulated gastric and intestinal digestion

通过对胃消化阶段和肠消化阶段的比较,发现在胃消化阶段(0～2 h),福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号提取液中多酚含量下降趋势较为明显,原因可能是多酚类物质在胃部消化过程中发生降解,导致多酚含量下降。刘翼翔等[26]采用体外消化模型模拟人体胃肠对蓝莓多酚的消化,发现胃消化后蓝莓多酚的总酚含量与总花色苷含量都没有发生明显变化,这与本文实验结果有所不同,需进一步实验验证。而在肠消化阶段(2～4 h),福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号多酚含量存在一定的回升趋势。原因可能是茶汤中多酚大分子受肠道环境影响分解为多酚小分子,其含量下降,但整体酚羟基含量上升,后当小分子被完全释放,受肠道环境影响,多酚含量再次下降。刘翼翔等[26]通过对蓝莓多酚在胃肠消化过程中总酚及总花色苷含量变化发现,经小肠消化后,总酚含量发生了明显降低,说明小肠pH7.4的弱碱性环境能够造成蓝莓多酚分解,与本实验结果一致,但多酚含量降低是否与胰蛋白酶发生了结合,随不溶解的蛋白酶一起丢失,还有待进一步验证。

2.2.2 体外模拟消化过程中黄酮变化规律 4 种茶叶提取液在模拟胃、肠消化过程中黄酮变化如图2所示,经过胃消化2 h后,福鼎大白、中黄一号、白叶一号黄酮含量分别下降16.52%、15.40%、19.88%,紫娟上升12.02%。再经过肠消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号黄酮含量分别上升43.26%、30.30%、9.29%、5.77%。

图2 4种茶叶提取液在模拟胃、 肠消化过程中黄酮含量变化趋势Fig.2 Changes of flavonoids content in four kinds of tea soup during simulated gastric and intestinal digestion

在胃消化阶段(0～2 h),福鼎大白、中黄一号、白叶一号黄酮含量下降趋势较为明显,原因可能是黄酮化合物在胃消化过程中稳定性较差。李俶等[27]人选取七种不同种类的酚类化合物,研究模拟体外胃肠道消化对其稳定性的影响,结果发现,类黄酮化合物在胃消化过程中稳定性较差,儿茶素下降17%、表儿茶素下降6%,这与本实验研究相符。而在紫娟提取液中某些黄酮大分子受环境影响分解为黄酮小分子,黄酮含量存在一定的上升,。在肠消化阶段(2～4 h),福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号黄酮含量明显提升,推测可能是在碱性环境下茶叶提取液中某些黄酮大分子受环境影响分解为黄酮小分子致使吸光值提高。唐琦等[28]通过体外模拟消化测定红小豆萌发前后总多酚、总黄酮含量的变化规律,发现碱性环境条件下,总黄酮含量增加,原因可能是酚酸类、花青素类在肠液偏碱性条件下发生降解,总多酚结构变化向更稳定的黄酮类转化,从而导致总黄酮含量增加。这与本文所述相同。

2.2.3 体外模拟消化过程中原花青素变化规律 4种茶叶提取液在模拟胃、肠消化过程中原花青素变化如图3所示,经过胃消化2 h后,福鼎大白、紫娟、白叶一号原花青素含量分别下降3.09%、2.24%、17.78%。再经过肠消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号原花青素含量分别下降22.87%、46.95%、10.89%、23.70%。

图3 4种茶叶提取液在模拟胃、 肠消化过程中原花青素含量变化趋势Fig.3 Changes of proanthocyanidins content in four kinds of tea soup during simulated gastric and intestinal digestion

在胃消化阶段(0～2 h),福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号原花青素含量下降趋势不明显,这与原花青素在酸性环境相对稳定有关。在肠消化阶段(2～2.5 h),福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号原花青素含量明显下降,这与其在碱性环境下不稳定有关。在肠消化阶段(2.5～4 h),福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号原花青素含量下降不明显。李华等[29]用不同的方法检测葡萄籽超微粉经体外消化后的抗氧化能力,通过对总酚和原花青素含量的测定发现原花青素在人工胃液中比较稳定,在人工肠液中呈缓慢分解趋势,这与本文结论一致。

2.2.4 体外模拟消化对抗氧化活性的影响 4种茶叶提取液在模拟体外消化过程的DPPH自由基清除能力变化如图4所示,DPPH自由基清除能力IC50值为0.92～1.46 mg VC/mL;其中,福鼎大白自由基清除能力最高。陈金娥等[30]用DPPH法研究红茶、绿茶、乌龙茶等八种茶叶活性成分的抗氧化性,得出茶叶中多酚含量顺序与其对自由基的清除能力大小顺序一致。福鼎大白茶多酚及总黄酮含量最高,与其DPPH自由基清除能力最高结果相符;在消化后,福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号DPPH自由基清除能力分别下降33.91%、41.78%、20.81%、31.55%,呈明显下降趋势。

图4 4种茶叶提取液DPPH自由基清除能力消化前后比较Fig.4 DPPH free radical scavenging ability comparison of 4 kinds of tea soup before and after digestion

4种茶叶提取液在模拟体外消化过程的ABTS自由基清除能力变化如图5所示,ABTS自由基清除能力IC50值在1.10～1.17 mg VC/mL之间,其紫娟ABTS+·抗氧化活性最高,其次为福鼎大白、中黄一号、白叶一号。戴妙妙等[31]通过比较紫鹃茶中花青素提取物和两种常用合成抗氧化剂BHA、BHT的抗氧化性及清除自由基能力,发现紫娟茶中花青素具有较强的抗氧化性活性及较强的清除自由基的能力。紫鹃茶原花青素含量最高,ABTS自由基清除能力最好,与本实验结果相符。在消化后,福鼎大白、紫娟、中黄一号、白叶一号ABTS自由基清除能力下降23.48%、29.06%、23.68%、23.64%,呈明显下降趋势。

图5 4茶叶提取液ABTS自由基清除能力消化前后比较Fig.5 ABTS free radical scavenging ability comparison of 4 kinds of tea soup before and after digestion

在体外模拟消化过程中,4种茶叶提取液的抗氧化活性(DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力)呈逐渐下降的趋势,这与尹世磊等[32]的研究结果相似。其中,DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力的下降率以紫娟最大,分别达到了41.78%、29.06%。4 种茶叶提取液在经过胃、肠消化后抗氧化值明显下降,不同方法测定抗氧化值的变化趋势均与多酚和黄酮含量的变化趋势相近。

3 结论

本实验通过体外模拟消化法对4种茶叶提取液中的抗氧化成分及其活性进行了研究。结果表明,4种茶叶提取液未消化前的活性成分存在差异。酚类物质含量范围为2.03(白叶一号)～2.32 mg GAE/mL(福鼎大白),黄酮含量范围为2.41(紫娟)～3.41 mg GA/mL(福鼎大白),原花青素的含量范围为0.16(中黄一号)～0.78 mg GA/mL(紫鹃)。4种茶叶提取液的抗氧化活性具有显著性差异(P<0.05),DPPH自由基清除能力IC50值0.92(中黄一号)～1.46 mg VC/mL(福鼎大白),ABTS自由基清除能力IC50值1.10(白叶一号)～1.17 mg VC/mL(紫娟)。在模拟胃肠消化中,茶汤提取液多酚下降12.59%～14.73%,黄酮提升5.77%～43.26%,原花青素下降10.89%～46.95%。在模拟胃肠消化中,4种茶叶提取液抗氧化活性均成下降趋势。DPPH自由基清除能力下降20.81%～41.78%,ABTS自由基清除能力下降23.48%～29.06%。体外模拟消化过程中多酚变化规律有待进一步实验。