玉米肽对慢性酒精中毒小鼠免疫功能的影响

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔 161006)

中国是酒类生产和消费大国,长期饮酒可导致全身多系统多器官损伤,除了最常见的肝脏和神经系统损伤,酒精的免疫毒性也越来越受到人们的关注。慢性酒精中毒对机体免疫系统有抑制作用,一方面,酒精可直接抑制脾脏和胸腺T淋巴细胞的生成量及其功能,降低免疫相关细胞因子的表达[1];另一方面,酒精可引起肝损伤,使得患者普遍出现体液免疫和细胞免疫异常,造成机体免疫力低下[2]。此外,长期过量饮酒还会导致蛋白质、能量及维生素摄入不足而产生营养不良,出现营养性免疫抑制[3]。因此研究开发拮抗酒精免疫毒性的天然、无毒、营养的保健食品是目前医学和食品科学领域共同关注的热点。

玉米肽是玉米蛋白的酶解产物,具有醒酒、保肝、抗疲劳、抗氧化等多种活性。近年来研究发现玉米肽还具有潜在的免疫调节作用。马子淇等[4-5]以玉米黄粉为原料,制备并纯化出免疫活性肽,发现其具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的能力,且有剂量依赖性。吴晓萌[6]发现玉米黄浆多肽能显著增加正常小鼠免疫器官指数、足跖肿胀程度、血清抗体水平及碳廓清能力。此外,张智等[7]将玉米肽与益生菌进行复合,发现该复合益生菌-玉米肽具有增强细胞免疫功能作用,并且能促进免疫球蛋白A的产生。玉米肽作为天然的保健食品,可减少药物治疗的副作用,保证消费者健康,必然受到消费者的欢迎。本文以具有自主知识产权的玉米肽为研究对象,探讨其对慢性酒精中毒小鼠免疫功能的影响,以期为进一步研究玉米源免疫活性肽的免疫增强作用及其机制提供新的理论依据。

表1 玉米肽对慢性酒精中毒小鼠体重、脾脏指数和胸腺指数的影响Table 1 Effect of corn peptide on body weight,spleen and thymus index of chronic alcoholism mice

注:不同小写字母表示同列数据间差异显著,P<0.05;表2同。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级昆明小鼠(18±2) g 60只 辽宁长生生物技术有限公司[质量合格证号 211002300019054,实验动物生产许可证为 SCXK(辽)2015-0001];玉米肽粉 齐齐哈尔易翔食品有限公司[蛋白含量49.5%,肽分子量<1 kDa,其余为淀粉];小鼠干扰素γ酶联免疫试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒、小鼠白介素6酶联免疫试剂盒 上海江莱生物科技有限公司;GSH、MDA和SOD试剂盒 南京建成生物生物科技有限公司;其它试剂均为常规试剂。

T-114分析天平 美国丹佛仪器;EnSpire全波长多功能酶标仪 美国珀金埃尔默公司;CF15RXII型高速离心机 日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物饲养与分组 昆明小鼠60只,雌雄各半,适应性喂养7 d 后,随机分为5组,每组12只,分别为正常对照组、慢性酒精中毒模型组、玉米肽高、中、低剂量组。

加肽鼠粮的制作:按肽的蛋白含量(g)和基础鼠粮重量(g)的比例1∶500、3∶500和5∶500制备加肽鼠粮,分别为低、中、高玉米肽剂量组。

模型建立:自由饮用含酒精水建立小鼠慢性酒精中毒模型,水中酒精体积分数由6%、9%、12%,各饲喂5 d后调整到20%,以20%的酒精浓度维持饲养5个月,正常对照组小鼠饮用不含酒精的水;正常对照组和酒精模型组饲喂正常鼠粮,玉米肽组饲喂加肽鼠粮,自由摄食。

1.2.2 脾脏指数/胸腺指数的测定 试验结束后,禁食、不禁水12 h,称重后处死小鼠,剥离脾脏和胸腺并称重,计算脾脏/体重和胸腺/体重比值(mg/g)。

1.2.3 病理组织学观察 试验结束后,小鼠脾脏和胸腺组织制成HE染色切片并做病理学观察。

1.2.4 血清中细胞因子的测定 试验结束后,禁食、不禁水12 h,称重后眼球取血,室温静置,析出血清后,于4 ℃、1000×g离心15 min,收集血清,按照各试剂盒说明书测定血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ含量。

1.2.5 血清及肝脏中GSH、MDA含量及SOD活性测定 试验结束后,禁食、不禁水12 h,称重后眼球取血,解剖取肝脏组织,使用生理盐水制备质量分数为10%组织研磨液,4 ℃、1000×g离心15 min,收集上清液,按照各试剂盒说明书测定GSH、MDA含量及SOD活性。

1.3 数据处理

应用SPSS 19.0软件,对数据进行单因素方差分析,差异显著者再进行LSD检验。各组数据结果以平均值±SD表示,不同小写字母角标表示各组数值比较差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 玉米肽对慢性酒精中毒小鼠免疫器官脏器指数的影响

由表1可知,与正常对照组相比,酒精模型组和玉米肽高中低三个剂量组的小鼠体重均显著降低(P<0.05),表明长期慢性的酒精处理可引起小鼠体重减轻;酒精模型组小鼠脾脏系数显著高于对照组(P<0.05),表明酒精处理后,小鼠脾脏出现肿大,但是胸腺的脏器指数尚未出现显著变化。玉米肽各剂量组对酒精引起的小鼠体重降低并未表现出显著的改善作用,但玉米肽中剂量组显著降低了小鼠脾脏系数(P<0.05),缓解了脾脏损伤,对酒后脾脏有一定的保护作用。

2.2 玉米肽对慢性酒精中毒小鼠脾脏和胸腺病理组织学的影响

脾脏是机体重要的外周免疫器官,拥有25%全身循环的T淋巴细胞,是免疫细胞增殖和接受抗原刺激产生相应免疫应答的场所。动物实验表明,长期过量饮酒对脾脏的生长发育具有显著的抑制作用,可引起脾细胞脂质过氧化,细胞膜通透性增强,膜表面受体受损,进而影响机体的各项免疫功能[8]。

图1 小鼠脾脏病理学观察结果(100×)Fig.1 Pathological observation results of spleen in mice(100×)

小鼠脾脏病理切片见图1。结果表明,与正常对照组相比,酒精模型组脾脏白髓比例增大,白髓内细胞数量增多;而与酒精模型组比较,玉米肽低剂量组脾脏红髓比例增多,可见较多含铁血黄素,白髓内细胞数量略减少,并可见细胞核溶解;玉米肽中剂量组中红髓比例明显增多,白髓内细胞数量减少,并可见细胞核溶解;玉米肽高剂量组脾脏中白髓比例较中剂量组增多,但仍可见细胞溶解。可见,玉米肽各剂量组脾脏白髓面积及细胞数量均得到不同程度的恢复。

图2 小鼠胸腺病理学观察结果(100×)Fig.2 Pathological observation results of thymus in mice(100×)

胸腺对机体T细胞分化、成熟起到重要作用,酒精可降低胸腺中淋巴细胞生成量及释放率[8]。由图2可见,酒精模型组小鼠胸腺已观察不到胸腺小叶,且皮质、髓质不明显;与正常对照组相比,玉米肽低剂量组的胸腺小叶及髓质也不明显。中剂量组可见血管充血,胸腺小叶内细胞之间距离变大。高剂量组仍可见血管充血,但胸腺小叶内细胞增多。玉米肽各剂量组胸腺病变均有不同程度的恢复,但恢复较轻,仅比模型组略佳。

2.3 玉米肽对慢性酒精中毒小鼠血清细胞因子的影响

由表2可知,与正常对照组相比,慢性酒精中毒导致小鼠血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6含量显著降低(P<0.05),这与报道相一致[9-10]。与酒精模型组相比,玉米肽中、高剂量组小鼠血清中TNF-α含量显著提高(P<0.05);玉米肽低、中、高三个剂量组小鼠血清中IFN-γ含量都有显著提高(P<0.05);并且高剂量玉米肽还显著提高了小鼠血清中IL-6的含量(P<0.05)。这些结果表明,玉米肽可以明显改善酒精模型组小鼠血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6水平。

表2 玉米肽对慢性酒精中毒小鼠血清细胞因子的影响Table 2 Effect of corn peptide on serum cytokine of chronic alcoholism mice

2.4 血清及肝脏组织中GSH、MDA含量及SOD活性

酒精代谢产生大量ROS,可消耗机体内的抗氧化物质,GSH是体内重要的抗氧化物质之一。由图3可知,酒精显著降低了小鼠肝脏中抗氧化剂GSH的含量(P<0.05),但是对血清中GSH的含量没有显著影响(P>0.05)。与酒精模型组相比,低、中、高剂量组玉米肽皆可显著降低酒精对肝脏中GSH的消耗(P<0.05),并且具有剂量依赖性,随着玉米肽含量的增加,肝脏中GSH含量也随之升高,恢复到正常水平。

图3 小鼠血清及肝脏中GSH浓度Fig.3 The concentration of GSH in plasma and liver of mice 注:不同小写字母表示差异显著,P<0.05;图4～图5同。

由图4可见,与正常对照组相比,酒精可显著增加小鼠肝脏及血清中MDA含量(P<0.05),MDA是脂质过氧化反应的产物,会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,且具有细胞毒性。与酒精模型组相比,中、高玉米肽剂量组的小鼠血清和肝脏中MDA含量显著降低(P<0.05);其中玉米肽高剂量组小鼠血清和肝脏中MDA水平与正常对照组相比没有显著差异(P>0.05)。这表明玉米肽可降低乙醇及其代谢产物引起的小鼠肝脏及血清中MDA水平的升高,保护免疫组织及细胞免受其毒性作用。

图4 小鼠血清及肝脏中MDA水平Fig.4 The levels of MDA in plasma and liver of mice

由图5可知,与正常对照组相比,酒精可显著降低小鼠血清及肝脏中SOD活性(P<0.05)。与酒精模型组相比,中、高玉米肽剂量组小鼠血清及肝脏中SOD活性显著升高(P<0.05)。其中玉米肽中剂量组小鼠血清和肝脏中SOD活性与正常对照组相比没有显著差异(P>0.05)。这表明玉米肽可恢复酒精中毒小鼠血清及肝脏中SOD活性。玉米肽本身就是一种抗氧化活性较强的活性寡肽,研究表明玉米肽可提高正常小鼠血清和肝脏中SOD活性,同时还可提高肝脏中GSH-PX活性[11]。

图5 小鼠血清及肝脏中SOD活性Fig.5 The activity of SOD in plasma and live of mice

3 讨论与结论

T细胞是机体细胞免疫的中心,可分泌多种细胞因子进而调节机体的免疫反应。其中细胞因子TNF-α具有强化中性粒细胞的吞噬能力,还可以增加过氧化物阴离子产生,刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶、抗感染。IFN-γ可通过激活单核吞噬细胞杀灭微生物及肿瘤细胞,激活中性粒细胞和NK细胞,强化NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,促进巨噬细胞的吞噬功能;IL-6是一种多效性细胞因子,在多种细胞功能调节方面具有重要的作用,包括细胞分化、免疫防御、增殖等;若IL-6水平降低,则会引起免疫系统中某个或多个节点发生障碍,从而导致机体免疫力下降[12]。长期酗酒可抑制T淋巴细胞的功能,使T淋巴细胞减少有丝分裂和对抗原的增殖反应下降,细胞因子IFN-γ的合成和NK细胞活性也会降低,并且单核细胞所产生的细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6也会下降[9];此外酒精引起营养不良,蛋白质的缺乏也可降低机体免疫力,因为免疫防御依赖于细胞复制和具有生物活性的蛋白质的产生,如抗体、细胞因子等[13]。玉米肽具有促进乙醇代谢的醒酒作用,可明显降低原发性高血压大鼠血液中乙醇及其氧化产物乙醛浓度的作用,同样的结果在健康人中也得到了印证[14-15]。在本研究中,与酒精模型组相比,高剂量玉米肽可以显著改善慢性酒精中毒导致的小鼠血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6含量的降低(P<0.05);一方面可能是因为玉米肽能够加快酒精代谢速度,从而降低酒精对机体的直接损害作用,另一方面可能是因为玉米肽可通过为机体补充大量的氨基酸减轻机体蛋白质缺乏状态,提高细胞因子的表达和活性,改善T淋巴细胞的功能,从而提高机体的免疫力。

酒精进入机体后,在乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶作用下,转变为乙醛,并通过CYP2E1产生了多种活性氧,如乙氧基自由基、超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等,导致机体氧化应激水平升高,损伤包括免疫细胞在内的各组织细胞;同时还可损害机体内保护性抗氧化剂,如降低机体中谷胱甘肽含量[16];乙醛还可以与其他蛋白质结合形成加合物,如丙二醛和丙二醛乙醛加合物[1],进而导致机体免疫机能的下降。玉米肽的体内外抗氧化活性已通过试验证实。马瑞等[17]发现玉米蛋白水解物可以通过直接降低细胞内ROS含量来保护细胞;Liu等[11]证明玉米蛋白水解物可提高小鼠血清中SOD活性,这些研究表明玉米蛋白水解物在细胞及动物体内具有明显的抗氧化作用。本研究发现,玉米肽可降低酒精对肝脏中GSH的消耗,并具有剂量依赖性;同时中、高剂量组玉米肽还可恢复酒精中毒小鼠血清及肝脏中SOD活性。所以玉米肽可能是通过减轻酒精及其代谢物引起的氧化应激,减少活性氧对机体细胞的损伤,改善慢性酒精中毒小鼠的脾脏和胸腺的损伤状况;此外玉米肽可降低乙醇及其代谢产物引起的小鼠肝脏及血清中MDA水平的升高,保护免疫组织及细胞免受MDA的毒性作用,从而辅助增强机体的免疫功能。

综上所述,长期过量酒精摄入会导致小鼠免疫器官损伤,降低机体免疫功能;玉米肽可明显提高小鼠血清因子水平,改善机体氧化应激状态,缓解慢性酒精中毒小鼠的脾脏和胸腺的损伤状况,在一定程度上可以提高机体的免疫功能,具有保健功能。