北虫草小麦培养残基中虫草素提取工艺优化

宋 洁 刘晓红

（辽东学院农学院，辽宁丹东118003）

北虫草（Cordyceps militaris）又称蛹虫草，属子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属[1]。随着北虫草市场需求不断上升，采收北虫草子实体后废弃培养基质会越来越多，其中以小麦培养基质居多。开发利用北虫草废弃基质小麦资源，可以大幅度降低生产成本，并具有一定市场潜力。虫草素是北虫草中重要生物活性物质之一，具有调节免疫力[2]、抑菌[3]、抗肿瘤[4-5]等作用。研究表明北虫草培养残基中含有虫草素[6]。响应面分析法（responsesurface methodology，RSM）是一种优化工艺条件的有效方法，可以确定试验考察因素及其之间交互作用在工艺过程中对响应值的影响，精确表述考察因素和响应值之间的关系[7，8]。试验将响应面分析方法应用于北虫草小麦培养残基虫草素超声提取工艺优化，探究响应值（多糖得率）与考察因素之间的数量关系，获得最优超声提取工艺并予以验证，为北虫草小麦培养残基开发利用提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北虫草小麦培养残基，由辽东生物产业研究所提供。样品于50℃烘干打粉，60目过筛备用。虫草素标准品（中国药品生物制品鉴定所），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。

日本岛津LC-10Avp高效液相色谱仪，SIL-10AVP自动进样器，SPD-10Avp紫外检测器，SCL-10Avp数据处理工作站，KQ5200DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 北虫草小麦培养残基中虫草素的提取及测定

准确称量北虫草小麦培养残基60目干粉5 g，加入适量甲醇超声提取、离心，取上清100 μL加入超纯水定容至1 mL，静置，得到待测液。

HPLC测定虫草素含量：色谱柱Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相（甲醇∶水=15∶85），流速1 mL/min，检测波长260 nm，进样量10 μL，温度25℃。

北虫草残基中虫草素提取率的计算公式为：

式中：M1为根据标准曲线计算出的被测液中虫草素的含量（μg），M2为称取的残基粉末的质量（g），V1为待测液分取的体积（mL），V2为待测液的总体积（mL）[9]，Y为北虫草残基中虫草素提取率。

1.2.2 单因素试验设计

超声时间水平确定：固定超声提取温度60℃、提取次数3次、液（mL）料（g）比20、超声功率100 W，超声时间分别为 15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min。

超声温度水平确定：固定超声时间15 min、提取次数3次、液（mL）料（g）比20、超声功率100 W，超声提取温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。

提取次数水平确定：固定超声时间15 min、超声温度60℃、液（mL）料（g）比20、超声功率100 W，提取次数分别为1次、2次、3次、4次、5次、6次。

液料比例水平确定：固定超声时间15 min、超声温度60℃、提取次数3次、超声功率100 W，液（mL）料（g）比分别为10、20、30、40、50、60。

超声功率水平确定：固定超声时间15 min、超声温度60℃、提取次数3次、液（mL）料（g）比20，超声功率分别为40 W、60 W、80 W、100 W、120 W、140 W。

分析上述不同条件下，对北虫草小麦残基中虫草素提取率的影响。按照1.2.1方法获得虫草素提取率。

1.2.3 Plackett-Burman试验设计

单因素试验基础上，采用Design-Expert.V8.0.6软件中Plackett-Burman设计，进行5因素2水平的一阶试验，筛选出对虫草素提取率具有显著影响作用的因素。

1.2.4 响应面Box-Behnken试验设计

基于Plackett-Burman设计筛选出影响虫草素提取率的显著因素，采用Design-Expert.V8.0.6软件，通过Box-Behnken设计进行3水平的二阶优化，获得最优超声提取北虫草小麦培养残基中虫草素的工艺方法，并进行模拟验证。

2 结果与分析

2.1 试验单因素对小麦培养残基虫草素提取率的影响

通过HPLC检测超声提取虫草素在不同超声时间、不同超声温度、不同提取次数、不同液料比、不同超声功率条件下，所积峰面积，利用公式计算出不同条件下，北虫草残基中虫草素提取率见图1（a、b、c、d、e）。

虫草素提取率随着超声提取时间延长而提高，当超声提取时间在45 min时最佳，时间延长对虫草素提取影响不大（图1a）；超声提取温度过高会破坏虫草素分子结构，60℃虫草素提取率最高，超过60℃后提取率降低（图1b）；提取次数大于3次，虫草素提取率基本没变（图1c）；提取料液比对虫草素提取率影响较大，相同北虫草培养残基，液（mL）料（g）比在30时，提取率最优（图1 d）。超声功率大于60 W对虫草素提取率影响不大，120 W虫草素提取率最高（图1e）。

图1 北虫草残基中虫草素提取率单因素试验结果

2.2 Plackett-Burman试验结果与分析

单因素试验基础上，采用Plackett-Burman设计（N=12）筛选对虫草素提取率显著影响因子，并输入因子超声时间（X1）、超声温度（X2）、提取次数（X4）、提取液料比（X5）、超声功率（X6），X3、X7为虚拟因子，每项均取高（+1）低水平（-1），响应值Y为虫草素提取率（%），具体见表1和表2。

利用Design-Expert.V8.0.6软件对Plackett-Burman试验结果分析。由表3中可以看出，模型具有极显著性，该模型可以用于北虫草小麦残基中虫草素提取率显著性影响因素分析=0.9874与R2=0.9770接近，该模型具有较好的解释力，精密度28.651＞4，Plackett-Burman试验设计可信度和精确度较好，各因素对响应值的影响可由P值看出，提取液料比（X5）对虫草素提取率影响极显著，超声时间（X1），超声温度（X2）对虫草素提取率影响显著，故选择此3个因素为响应面法试验因素。

表1 Plackett-Burman试验因素水平

表2 N=12的Plackett-Burman试验设计及结果

表3 Plackett-Burman试验模型方差分析

2.3 响应面Box-Behnken试验结果与分析

结合单因素试验和Plackett-Burman结果，利用响应面Box-Behnken试验设计，固定提取次数（3次），超声功率（120 W），选择超声时间（X1）、超声温度（X2），提取液料比（X5）为自变量，虫草素提取率（Y）为因变量，响应面试验因素水平见表4，响应面试验设计及结果见表5。

表4 响应面Box-Behnken试验因素水平

表5 响应面Box-Behnken试验设计及结果

利用Design-Expert.V8.0.6软件对响应面Box-Behnken试验结果进行二次多元回归方差拟合，获得回归方程为：Y=0.067+0.016×X1+6.013×10～3X2+0.029X5-5.975×10-3X1X2-2.883×10-3X1X5+1.100×10-3XX-7.326×10-3-3.159×10-3+4.899×10-3根据回归方程模型方差分析显示：模型P值极显著，失拟项P值0.0625＞0.05不显著，虫草素提取率（Y）与回归方程关系好，误差较小，相关系数R2=0.9948，模型拟合程度好，R2Adj=0.9882与R2接近，有较好的解释力，可以解释98.82%的响应值变化，该模型可用于北虫草小麦残基中虫草素提取率分析与预测，具体见表6。

从响应面Box-Behnken试验模型方差分析表6中显示回归方程一次项X1、X2、X5、二次项X12、X52的P值均达到极显著的水平，二次项X22的P值为显著水平，说明超声时间、超声温度、提取液料比对虫草素提取率影响显著。二次项X1X2的P值极显著，表明超声时间与超声温度的交互作用对虫草素提取率影响极显著。从图2的响应面与等高线中可以看出，超声时间和超声温度对虫草素提取率的影响均呈抛物线型，等高线斜率大，曲面较陡。当固定提取液（mL）料（g）比为20，虫草素提取率随着超声时间延长不断升高后呈抛物线下降趋势，当超声时间为45 min，虫草素提取率最大，超声温度提高到60℃，抛物线达到至高点，随后虫草素提取率呈下降趋势。

表6 响应面Box-Behnken试验模型方差分析

图2 超声时间和超声温度交互作用对虫草素提取率影响的曲面和等高线图

根据表5试验结果得到回归方程，进一步分析获得最优提取工艺条件：当超声时间45 min，超声温度45℃，提取液（mL）料（g）比20时，虫草素提取率理论预测值为0.1037%，实验过程中预测值95%可能性在0.0941%到0.1133%之间。

最优提取工艺条件验证试验：对最优工艺进行3次重复试验取平均值为0.0994%，低于理论值，但在预测值范围内，说明响应面Box-Behnken试验设计得到超声提取模型准确可靠。具体见表7。

表7 最优提取工艺验证

3 小结

采用超声提取北虫草小麦培养残基中虫草素，在单因素试验基础上，采用Plackett-Burman试验筛选出显著性影响因素。通过Box-Behnken响应面法优化北虫草小麦培养残基中虫草素超声提取工艺，结果表明：超声提取北虫草小麦培养残基中虫草素最优工艺条件为：超声时间45 min，超声温度45℃，提 取 液（mL）料（g）比 20，虫 草 素 提 取 率 为0.0994%。