传统大豆发酵食品中纳豆芽孢杆菌的 分离及纳豆发酵

刘彦敏，沈 璐，王 康，严金平，伊日布斯

（昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

纳豆是大豆经枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵而成的一种传统食品。1906年Swamula[1]首次从纳豆中筛选到了枯草芽孢杆菌属的新型菌株，将其命名为纳豆芽孢杆菌（B. subtilis natto）。纳豆芽孢杆菌可合成纳豆激酶，生产以聚谷氨酸（poly-L-glutamic acid，γ-PGA）为成分的黏性物质，以及具有生物缺陷型特性，以上特点是其区别于其他枯草芽孢杆菌的主要性状[2-3]。因其芽孢结构具有耐受各种环境迫的能力[4]，能在肠道中定植生长，促进机体对营养物质的分解与吸收。同时纳豆芽孢杆菌发酵的纳豆还具有溶解血栓、降血压、预防骨质疏松、抗氧化和增强机体的免疫等功能[5]。

1987年Sumi等[6]首次从纳豆中纯化出纳豆激酶，并在后续研究中证明了纳豆激酶具有溶解血栓、降低血黏度、改善血液循环、软化和增加血管弹性等作用。从纳豆及纳豆芽孢杆菌引起了前所未有的关注。国内外的科研工作者陆续从传统的发酵豆制品中筛选到了产纳豆激酶菌株。Jeong等[7]从韩国传统豆酱（doenjang）中筛选到产γ-PGA、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶并可发酵低盐豆酱的菌株D2-2和D12-5。我国学者也从中国的传统发酵豆制品中筛选到了高产纳豆激酶、拉丝效果良好、具有光抗菌活性和热稳定性的纳豆发酵菌株[8-12]。董明盛等[13]从中国豆豉中筛选到有明显纤溶活性的纳豆芽孢杆菌株NK-5，试制的纳豆在4 ℃贮存两个月仍能保持70%纳豆激酶活力。王成涛等[14]从中国的24 种豆制品中筛选到高产纤溶酶的菌株BN-6，纤溶酶活性达900 U/mL。

枯草芽孢杆菌广泛分布于自然界的不同环境中，研究证明其16S rRNA基因序列不能明确区分其不同表型性状的亚种和菌株，Qin Huibin[15]和Xu Dong[16]等利用内转录间隔区序列（internal transcribed spacer，ITS），对枯草芽孢杆菌种内的不同菌株进行了系统发育学分析。

目前，我国的纳豆生产菌株依赖进口，工业菌株和生产工艺的开发滞后，再加上我国消费者对纳豆感官的不适应等问题严重限制了我国纳豆产业的发展。我国传统大豆发酵食品历史悠久，但对大豆发酵食品的发酵菌株和功能菌株的研究还较少。本研究以蛋白酶、纳豆激酶、产γ-PGA性能和生物依赖特性为筛选指标，从传统大豆发酵食品和稻草中分离获得8 株具有典型纳豆芽孢杆菌特性的枯草芽孢杆菌菌株，进行形态学和系统发育分析，进一步通过纳豆发酵实验获得具有纳豆激酶活性、感官效果良好的本地化纳豆食品，以期获得有良好的商业化前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆酱由河南省新乡市家庭自制；豆豉由云南省腾冲市家庭自制；稻草 云南省玉溪市农家。

1.1.2 参考菌株

市售纳豆发酵剂中纯化的菌株B. subtilis natto NR（简称NR） 日本成濑发酵化学研究所；市售纳豆发酵剂中纯化的菌株B. subtilis natto MG（简称MG） 日本宫城野纳豆制作研究所；市售纳豆发酵剂中纯化的菌株B. subtilis natto KT（简称KT） 日本高桥保藏研究所；B. subtilis 168菌株（简称168，不能产纳豆的枯草芽孢杆菌，作为纳豆发酵的负对照菌株） 广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.3 培养基与试剂

NBP培养基：1%牛肉膏、1%大豆蛋白胨、0.5% NaCl、2%琼脂，pH 7.0。

蛋白酶活性菌株筛选的培养基（脱脂奶培养基）：10%脱脂奶、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、2%琼脂，pH 7.2～7.4。

产细胞外黏性多糖菌株筛选的培养基（GSP培养基）：3%蔗糖、1.5%大豆蛋白胨、0.25% KH2PO4、0.17% Na2HPO4、0.05% NaCl、0.05% MgCl2g 7H2O、1.5%一水合谷氨酸钠、100 μg/L生物、2%琼脂。

Taq Buffer、dNTP、Taq酶 北京全式金生物技术有限公司；尿激酶 上海源叶生物科技有限公司；纤维蛋白酶原、凝血酶（100 U/mL） 西格玛奥德里奇 （上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

PH104A恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；4802UV/VIS紫外-可见光分光光度计 尤尼科仪器有限公司；G154DW高压蒸汽灭菌锅 至微仪器有限公司；DM显微镜 徕卡仪器（德国）有限公司；RH basic 2磁力搅拌器 德国IKA公司；SSW-420-2S恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司；THZ-072HT控温摇床 上海申能博彩生物科技有限公司；2720 Thermal Cycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、Heraeus Fresco 17R台式低温高速离心机 美国赛默飞世尔科技 （中国）有限公司；干式恒温器 杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳豆芽孢杆菌的初筛

分别称取2 g河南豆酱、腾冲豆豉和玉溪稻草（稻草剪切成1 cm长的片段）加入50 mL 0.09%的灭菌生理盐水中，室温搅拌10 min后，80 ℃金属浴加热20 min。冷却至室温，进行系列梯度稀释，稀释后取104、105、 106、107、108五个梯度分别涂布于NBP琼脂培养基上，每个梯度做3 个平行。涂布的平板37 ℃培养48 h后，挑取平板上独立的菌落于NBP液体培养基中培养备用。

1.3.2 纳豆芽孢杆菌的复筛

表 1 复筛的评分标准Table 1 Grading criteria for rescreening

1.3.3 纳豆芽孢杆菌的初步鉴定

1.3.3.1 菌株形态学观察观察并记录菌落特征；对筛选菌株的活菌和芽孢进行染色，并在显微镜下观察细胞结构[17]。

1.3.3.2 纳豆芽孢杆菌的系统发育分析

提取所筛菌株的基因组D N A 作为P C R 模板。合 成1 6 S r R N A 和I T S 引 物[15]（由B i o s u n e 公 司 合成），引物序列如表2所示；PCR采用25 μL体系：10h PCR Buffer 2.2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）2.5 μL；ddH2O 17.5 μL；上下游引物（10 μmol/L）分别为0.5 μL；DNA模板1 μL；Taq酶0.5 μL。16S rRNA的PCR设定程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，共30 个循环；ITS的PCR设定程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环；使用无菌的ddH2O作为性对照。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，经纯化回收后交由Biosune公司测序。使用NCBI数据库的BLAST程序对测序的16S rRNA、ITS基因序列进行同源性比对，并用MEGA 7.0软件通过Neighbor-Joining法构建系统发育树[18]。

表 2 PCR扩增引物序列Table 2 Sequences of primers used for PCR amplification

1.3.4 分离菌株发酵的纳豆粗酶液中纳豆激酶活性分析

1.3.4.1 尿激酶标准曲线

参考Kim[19]和Astrup[20]等的方法，配制纤维蛋白平板。取2.5 mL纤维蛋白原（溶解于pH 7.4、0.1 mol/L 磷酸盐钠缓冲液）、0.1 mL凝血酶（100 U/mL）和7.4 mL 1 g/100 mL琼脂糖溶液加入到直径为9 cm的无菌平板中，小心振荡，混匀，室温放置30 min，打孔备用。分别取2 μL 200、400、600、800、1 000 U/mL的尿激酶，每个浓度做3 个平行，点于纤维蛋白平板的孔中，37 ℃温育8 h后，用游标卡尺测量水解圈直径，并计溶解圈的平均面积。以溶解圈面积（mm2）为横坐标，尿激酶浓 度（U/mL）为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线。

1.3.4.2 纳豆粗酶液中的纳豆激酶活性测定

使用MG、NR、TK、168、HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21作为发酵剂，制作纳豆。称取2 g制作的纳豆加入6 mL灭菌生理盐水中，4 ℃静置提取24 h或30 ℃振荡提取30 min，4 ℃、10 000h g离心10 min，取2 μL上清粗酶液点于纤维蛋白平板的孔内，每个品做3 个平行，37 ℃温育8 h；用游标卡尺测量溶解圈直径，并计出溶解圈的平均面积；根据尿激酶标准曲线计所获菌株制作纳豆粗酶液的纳豆激酶活性。

1.3.5 纳豆发酵工艺及感官评价

参考奚锐华等[21]优化的纳豆生产工艺。纳豆的制作流程设计如下：

1.3.5.1 纳豆发酵方法及要点

1）制备种子发酵液：活化2 代的菌株接种于NBP液体培养基中，37 ℃、170 r/min培养16 h；2）挑选大豆：挑选粒度小而均匀的大豆；3）清洗：用自来水清洗大豆表面的沙土、尘埃和有机物；4）浸泡：20 ℃自来水浸泡16 h（对浸泡前、后的10 粒大豆质量为2.3 倍为准，称质量并记录）；5）蒸煮：称取25 g浸泡后的大豆装入灭菌容器中（盖有可透气的滤膜）；121 ℃（0.1 MPa）蒸煮30 min；6）接种与发酵：活化好的种子液浓度调到1h 104CFU/mL后接种，39 ℃发酵18 h至大豆表面布满致密白色粉末状物质；7）后熟：4 ℃后熟24 h。

1.3.5.2 感官评价

采用4 个指标的5 分制进行评分（表3）。由10 人组成感官评价小组，采取盲评模式，去掉1 个最高分和1 个最低分，实验设计者不参与评分，取8 个得分的平均值。其中纳豆的拉丝评分是将纳豆均匀搅拌2 min后，观测黏液的量，然后用筷子挑起，以10 cm为一单位，从中间挑起，垂直拉丝10 cm为单位，再从拉起10 cm中挑起，依次重复进行，直至拉断。

表 3 感官评价标准Table 3 Criteria for sensory evaluation

1.4 数据统计分析

每组实验重复3 次，利用Microsoft Office Excel 2010对实验所得数据进行处理和作图。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌的筛选

表 4 8 株菌株的筛选结果Table 4 Screening results of 8 strains

2.2 分离菌株的鉴定

2.2.1 分离菌株的形态学特征

图 1 8 株所获菌株的形态学观察结果Fig. 1 Morphological observations of 8 selected strains

如图1所示，菌落表面呈乳白色或微黄色，湿润，不透明，扁平有褶皱，菌落形态呈近圆形。革兰氏阳性，细胞呈短杆状，单个或链状排列。在高温、低温、干燥、光线和化学药物存的等不稳定的条件下产生芽孢。具有枯草芽孢杆菌的形态学特征[17]。

2.2.2 分离菌株的系统发育分析

表 5 16S rRNA序列分析Table 5 Analysis of 16S rRNA sequences

使用NCBI数据库的BLAST程序进行序列比对[22]的结果表明所获8 株分离菌株的16S rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌的不同菌株显示最高的相似性均为100% （表5）。虽然与纳豆芽孢杆菌为同一物种，但是这些同源性较高的菌株中没有检索到纳豆芽孢杆菌。

图 2 分离菌株与商业菌株及已知纳豆芽孢杆菌的ITS系统发育分析Fig. 2 Phylogenetic tree of isolated strains, commercial strains and known strains of B. subtilis natto

2.3 分离菌株纳豆粗酶液中的纳豆激酶活性

根据Kim等[19]方法，使用纤维蛋白平板法测定纳豆粗酶液中的纳豆激酶活性。不同浓度尿激酶和不同菌株发酵的纳豆粗酶液在纤维蛋白平板上反应后都可见不同大小的溶解圈。尿激酶标准曲线为 y=8.103 4x909.02（R2=0.995 4），根据标准曲线计所获菌株发酵的纳豆粗酶液的纳豆激酶活性。结果显示，所有品中，纳豆粗酶液中纳豆激酶活性最高的菌株是市售纳豆芽孢杆菌株MG和KT，活性分别为 731 U/mL和898 U/mL；本研究从腾冲家庭自制豆豉中筛选到的2 株纳豆芽孢杆菌TC100和TC103的纳豆粗酶液中纳豆激酶活性最强，分别为550 U/mL和519 U/mL；从玉溪稻草中筛选到的纳豆芽孢杆菌DC21发酵的纳豆粗酶液纳豆激酶活性为483 U/mL；从河南豆酱中筛选到发酵纳豆粗酶液中纳豆激酶活性较高的菌株是HN67和HN72，活性分别为299 U/mL和231 U/mL；除HN10、HN48、HN35，其他菌株发酵的纳豆粗酶液的纳豆激酶活性都高于市售纳豆芽孢杆菌株NR。HN10和HN48获得的纳豆粗酶液的溶解圈面积较小，超出标准曲线的有效范围，但肉眼能明显观测到它们的溶解圈（图3）。

2.4 分离菌株的纳豆发酵及感官评价

根据奚锐华等[21]的纳豆生产工艺进行优化，并制定纳豆的感官评价方法。所获8 株菌株均能成功发酵纳豆（图4），经过感官评价（表6），结果显示HN48、TC100菌株试制的纳豆的感官评价分数最高，均为19 分，和市售纳豆纳豆芽孢杆菌菌株（MG、KT、NR）发酵的纳豆（感官评分20 分）感官差异较小，发酵的纳豆有纳豆香味、合成黏液多，拉丝长（30～40 cm），口感滑润。

图 4 纳豆发酵样品Fig. 4 Photographs of natto samples

表 6 试制纳豆的感官评分结果Table 6 Sensory evaluation of natto samples

3 讨 论

本研究根据纳豆芽孢杆菌具有产蛋白酶、γ-PGA、纳豆激酶和生物缺陷4 个筛选指标[2-3]，从河南豆酱、腾冲豆豉和玉溪稻草品中的326 株产芽孢菌株中筛选到8 株：HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21。传统的大豆发酵食品经原料和环境中微生物自然发酵而制成[23]，目前已有很多关于从传统发酵豆豉中筛选得到纳豆芽孢杆菌的 报道[6-7,10-11,24-25]。这些报道中大部分是根据纳豆芽孢杆菌的一种或两种特性，尤其是纳豆激酶特性[26]为筛选指标，容易导致筛选到的产纳豆激酶菌株不能生产纳豆或纳豆生产效果不佳的问题。目前关于传统豆酱和稻草中筛选获得纳豆芽孢杆菌的研究不多[25,27]，本研究根据纳豆芽孢杆菌特性的4 个筛选指标，从不同地区的传统发酵豆制品和稻草中的产芽孢菌株中筛选到8 株具有纳豆芽孢杆菌特征的菌株，并都能用于生产纳豆。

根据分离菌株的形态特征和ITS序列分析鉴定了所获8 个菌株为枯草芽孢杆菌的纳豆芽孢杆菌亚种 （B. subtilis natto）。枯草芽孢杆菌种内16S rRNA基因序列相对保守，通常很难用于区分物种内的不同表型性状的菌株[28]。Qin Huibin等[15]利用ITS序列，对枯草芽孢杆菌种内的不同菌株进行了系统发育学分析[15]。本研究采用ITS序列分析分离菌株与枯草芽孢杆菌种群内的系统发育关系，将采用16S rRNA不能区分的种内关系有效区分出来[15,29]，结果显示所筛菌株均是纳豆芽孢杆菌。最近也有研究指出IS4Bsu1和IS256Bsu1是纳豆芽孢杆菌特有的基因序列，可以根据IS4Bsu1和IS256Bsu1基因序列的有无鉴定纳豆芽孢杆菌[30]。还有研究提出对16S rRNA和5 个其他功能基因（rpoB、purH、gyrA、groEL、polC）序列的多性进行分析，可以作为确定纳豆芽孢杆菌分类地位的一种方法[28]，Kubo等[24]根据该方法从日本稻草中筛选获得能发酵黑大豆的纳豆芽孢杆菌Miyagi-4100。

本研究筛选的纳豆芽孢杆菌都具有产纳豆激酶和发酵大豆生产纳豆的能力，根据其大豆发酵产物中纳豆激酶活性，来源于云南省腾冲市家庭自制豆豉的TC100和TC103菌株的纳豆激酶活性最高，分别为550 U/mL和519 U/mL。而来源于河南省新乡市家庭自制豆酱的HN48和云南省腾冲市家庭自制豆豉的TC100菌株，发酵大豆所得纳豆的感官评价最高，评价分数均是19 分。纳豆激酶是一种微生物来源的蛋白酶，因具有纤维蛋白溶解活性而有别于其他蛋白酶，最初从传统的日本大豆发酵食品纳豆中被提取和纯化[5]。1990年Sumi等[31]首先建立了标准纤维蛋白平板技术测定纳豆的纳豆激酶活性。目前已经有很多关于芽孢杆菌属微生物能产多种纤维蛋白溶解酶的报道。而在这些酶中纳豆激酶因其在体内体外均能发挥纤维蛋白溶解活性而被大众广泛关注[3,32]。近年来，纳豆的保健功效受到越来越多研究人员及消费者的重视，世界各国对其功能因子的研究方兴未艾[33]。纳豆的保健功效与其发酵菌株的产酶能力尤其是纳豆激酶活性密切相关。同时作为食品，纳豆的外观、拉丝、气味和口感也是影响其商品价值的重要因，其中γ-PGA产量越高，黏液就越多，拉丝效果和口感也就越好[34]。本研究筛选得到的8 株菌株中TC100菌株是高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌，有望作为纳豆生产的候选菌株。