α-生育酚、γ-谷维素及植物甾醇在乙酸乙酯介质中清除自由基相互作用研究

张莉莎，倪菁潞，刘睿杰，常 明，金青哲，王兴国

(江南大学 食品学院，国家功能食品工程技术研究中心，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡214122)

脂质伴随物是植物油中一类具有生物活性的化学物质总称，包括酚类、植物甾醇、谷维素、角鲨烯、类胡萝卜素等，这些伴随物结构中均含有活泼酚羟基，可捕获过量自由基，因此具有很强的抗氧化能力[1]。

有研究表明，植物的强抗氧化能力并非单个化合物的贡献，而是多个组分共同作用的结果。不同抗氧化剂联用时可能会出现不同结果[2]。当复合抗氧化剂效果大于单独抗氧化剂效果时为协同作用，等于单独抗氧化剂效果时为加和作用，而小于时则为拮抗作用[3]。在油脂复杂体系中，各脂质伴随物均具有抗氧化作用，相互之间必然也存在抗氧化作用。另有学者称在不同溶剂体系中，抗氧化剂清除自由基的机制不同[4]，而这种不同机制可能会使抗氧化剂之间相互作用类型改变[5]。近年，乙酸乙酯作为有效溶解脂质分子的理想溶剂在研究植物油脂溶性成分抗氧化等诸多方面均有应用[6-7]。

鉴于此，本研究选择乙酸乙酯作为理想化的非极性介质，利用Bliss模型研究α-生育酚、γ-谷维素以及植物甾醇3种脂质伴随物抗氧化相互作用类型及机理。研究结果可为探讨脂质伴随物在真实油脂介质中的相互作用提供理论借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

植物甾醇(5%豆甾醇、75%β-谷甾醇和15%菜油甾醇)标准品、α-生育酚标准品、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基标准品，美国Sigma公司；γ-谷维素(39%环木菠萝烯醇阿魏酸酯、50% 24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯和6%菜油甾醇阿魏酸酯)，购自加拿大多伦多化学研究所；乙酸乙酯(分析纯)，购自上海国药试剂公司。

1.1.2 仪器与设备

EL204电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-2100分光光度计，Unico公司；Multiskan GO全波长酶标仪，美国Thermo公司；NEXUS傅里叶变换红外光谱仪，美国尼高力仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单独抗氧化剂与混合抗氧化剂储备液配制

用乙酸乙酯分别配制1 mmol/Lα-生育酚、γ-谷维素及植物甾醇储备液，并保存于-18℃。单独抗氧化剂工作液用储备液分别稀释为:α-生育酚25、50、100、200、400、500、800、1 000 mg/kg，γ-谷维素和植物甾醇250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000、20 000 mg/kg。复合抗氧化剂溶液按照体积比1∶1配制，复配后体系中3种脂质伴随物实际含量见表1。

表1 复配后体系中3种脂质伴随物实际含量 mg/kg

1.2.2 DPPH自由基清除能力的测定

在Espín等[8]的评价方法上略有改动，用乙酸乙酯配制0.1 mmol/L DPPH溶液，取2.0 mL 于5 mL 离心管中，加入100 μL样液，室温下避光反应30 min，反应结束后，于517 nm波长下检测吸光度的变化。DPPH自由基清除能力(ESC)按式(1)计算。

(1)

式中：A0为100 μL乙酸乙酯+2.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ai为100 μL样液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度；Aj为100 μL样液+2.0 mL 乙酸乙酯的吸光度。

1.2.3 协同度计算

协同度(SE)按式(2)和式(3)计算。

(2)

(3)

式中：TSCmix表示复配体系中理论DPPH自由基清除能力；ESCmix表示复配体系中实际DPPH自由基清除能力；ESCA和ESCB分别表示复配体系中组分A和组分B的DPPH自由基清除能力。

当SE<1时，表明两种物质复配呈现拮抗作用；SE>1时，表明两种物质复配呈现协同作用；SE接近1时，两种物质复配呈现加和作用。协同作用、拮抗作用或加和作用取决于DPPH自由基清除能力的理论值与实验值之间是否存在数学上的统计学差异。

1.2.4 单独抗氧化剂及复合抗氧化剂动力学探究

通过监测最大波长处的DPPH吸光度随时间的变化确定3种脂质伴随物以及复配体系清除DPPH自由基过程[9]。反应在全波长酶标仪中进行。通过将100 μL样品与100 μL DPPH溶液(1 mmol/L)加入至96孔酶标板，波长为517 nm，每隔20 s记录一次吸光度的变化，计算DPPH自由基清除能力，直至反应达到平衡，以此进行样品的动力学分析。

1.2.5 傅里叶变换红外光谱探究相互作用机理

使用分辨率为±0.5 cm-1的傅里叶变换红外光谱仪评估形成的氢键。傅里叶变换红外光谱仪由OMNIC软件控制，通过在玛瑙研钵中与溴化钾(KBr)粉末混合制备样品，在4 000～400 cm-1的范围内，每次测量收集平均32次扫描。

1.2.6 数据处理

以上所有实验至少重复3次，数据均以“平均值±标准偏差”表示，采用SPSS22软件进行数据统计分析。组间差异采用One-way ANOVA方差分析，Post-Hot 采用Duncan检验，P<0.05，差异具有显著性；P<0.01，差异具有极显著性。数据绘图采用Origin 8.0软件。

2 结果与讨论

2.1 3种脂质伴随物DPPH自由基清除能力(见图1)

图1 3种脂质伴随物DDPH自由基清除能力

由图1可知，α-生育酚(25～1 000 mg/kg)DPPH自由基清除能力最强，在含量为1 000 mg/kg时，DPPH自由基清除能力达到98.1%，虽然其分子结构中只含有一个供氢原子的酚羟基，但被认为是植物油微量物质中最有效的自由基清除化合物[10]。γ-谷维素在250～20 000 mg/kg范围内，DPPH自由基清除能力逐渐增强，在含量为1 000 mg/kg时，DPPH自由基清除能力达到38.4%。γ-谷维素是阿魏酸与甾醇的酯化物，其之所以具有抗氧化能力，得益于其结构上的阿魏酸。在同等含量下，α-生育酚DPPH自由基清除能力约为γ-谷维素的2.55倍。当γ-谷维素的含量增大至8 000 mg/kg时，其DPPH自由基清除能力达到91.2%，之后基本保持不变。而植物甾醇在250～20 000 mg/kg范围内，DPPH自由基清除能力仅为2%左右，这与前人的研究结果相同[11]。植物甾醇几乎没有清除DPPH自由基能力。可见，在乙酸乙酯介质中3种脂质伴随物清除DPPH自由基能力大小为α-生育酚>γ-谷维素>植物甾醇。

2.2 复合抗氧化剂DDPH自由基清除能力及相互作用类型

图2为3种脂质伴随物在乙酸乙酯中的相互作用结果，分别显示了在乙酸乙酯介质中，α-生育酚+γ-谷维素、α-生育酚+植物甾醇以及γ-谷维素+植物甾醇复配后采用Bliss模型所计算的清除DPPH自由基相互作用类型。

注：*为P<0.05，**为P<0.01，表示理论值和实验值有显著差异。

图2 复合抗氧化剂DPPH自由基清除能力及相互作用类型

由图2(a)可以看出，α-生育酚与γ-谷维素在所有复配含量下组成的复合抗氧化剂的SE值都小于1，表现为拮抗作用，且复配后其清除DPPH自由基能力的实验值与理论值之间存在极显著差异(P<0.01)。500 mg/kgα-生育酚与10 000 mg/kgγ-谷维素复配(M6)的SE值最高，为0.96，DPPH自由基清除能力实际值为92.63%，理论值为96.81%，降低4.3%。由图2(b)可以看出，α-生育酚与植物甾醇的相互作用类型几乎全表现为拮抗作用。500 mg/kgα-生育酚与10 000 mg/kg植物甾醇复配(M12)，其相互作用类型为加和作用，SE值为1.00，DPPH自由基清除能力实际值比理论值低0.5%，理论值与实验值之间无显著性差异。由图2(c)可以看出，γ-谷维素与植物甾醇在前两种含量复配(M13，M14)下表现为加和作用，而10 000 mg/kgγ-谷维素和10 000 mg/kg植物甾醇复配(M18)，SE值等于0.93，DPPH自由基清除能力实际值为88.01%，理论值为94.40%，降低了6.8%，两者之间存在极显著性差异，表现为拮抗作用。可见，脂质伴随物的含量会影响物质相互作用程度甚至相互作用类型[12]。有研究表明，在同一介质中抗氧化剂的相互作用类型与其氧化还原电动势有关。γ-谷维素与植物甾醇的氧化还原电动势比α-生育酚高，可能会抑制α-生育酚的重生，从而导致拮抗作用的产生[13]。

2.3 单独抗氧化剂及复合抗氧化剂动力学探究

为了进一步探索在α-生育酚分别与γ-谷维素和植物甾醇复配以及谷维素与植物甾醇复配后在乙酸乙酯非极性介质中清除自由基相互作用机理，运用动力学进一步监测200 s内吸光度的变化。通过比较抗氧化剂单独和复配后清除自由基的速率，进一步揭示3种脂质伴随物复配后的抗氧化机理。DPPH自由基清除能力和时间依赖性的数学模型是指数函数，公式如下：

y=a(1-e-bx)

(4)

式中：y为DPPH自由基清除能力；a和b为拟合系数；x为时间。

基于等式(4)中的参数a和b进行非线性回归拟合，绘制得图3中的曲线，拟合参数见表2。

注：单独抗氧化剂中α-生育酚含量500 mg/kg，γ-谷维素和植物甾醇含量均为10 000 mg/kg。下同。

图3 3种单独和复合抗氧化剂DPPH自由基清除动力学曲线

由图3可以看出，在实验含量范围内，几种脂质伴随物及其组合反应速率快慢为α-生育酚≈α-生育酚+γ-谷维素≈α-生育酚+植物甾醇>γ-谷维素≈γ-谷维素+植物甾醇>植物甾醇。表明当复配体系中主抗氧化剂含量达到一定程度后，将会决定体系清除DPPH自由基的速率。

DPPH自由基清除速率(RS)可用来比较3种脂质伴随物单独及复配后与DPPH自由基的反应快慢。对于所有非线性动力学反应，唯一有用的速率是最大值[14]。因此，对等式(4)进行求导，通过计算每条曲线的速率，进而求得时间等于2 s时各自的实际速率大小，结果见表2。

表2 DPPH自由基清除动力学参数

由表2可知，单独抗氧化剂(除植物甾醇外)和复合抗氧化剂清除DPPH自由基动力学曲线决定系数及校正系数均达到0.9以上，指数函数拟合曲线较好。复合抗氧化剂反应速率取决于复配体系中主抗氧化剂的反应速率。在时间为2 s时，α-生育酚单独清除DPPH自由基的反应速率为9.114 s-1，而α-生育酚+植物甾醇在同一时间下的反应速率最快，为10.346 s-1。500 mg/kgα-生育酚与10 000 mg/kg植物甾醇复配(M12)后，清除DPPH自由基能力达到61.46%(见图2(b))，与等含量下α-生育酚清除DPPH自由基能力60.31%接近(见图1)，表明此含量下植物甾醇对α-生育酚清除DPPH自由基能力的影响很小。500 mg/kgα-生育酚+10 000 mg/kgγ-谷维素复配之后的反应速率略微加快，但整体清除DPPH自由基能力的实验值较理论值低，呈现拮抗作用(见图2(a))。10 000 mg/kgγ-谷维素与10 000 mg/kg植物甾醇复配的反应速率较单独γ-谷维素的低，两者复配(M18)的DPPH自由基清除能力达到88%(见图2(c))，较单独10 000 mg/kgγ-谷维素DPPH自由基清除能力(92%)(见图1)低，在同样反应时间内，使得复配体系清除DPPH自由基的能力较弱。

2.4 傅里叶变换红外光谱探究相互作用机理

在乙酸乙酯介质中，单独抗氧化剂、抗氧化剂两两以溶液形式进行复配后，均用N2将溶剂吹干。然后通过傅里叶变换红外光谱检测体系中的羟基键，通过羟基键的变动推测复配后体系中有无氢键存在。图4显示了3种脂质伴随物及复配后的红外光谱图。

图4 α-生育酚、γ-谷维素、植物甾醇及复配后的红外光谱图

由图4可以看出，当α-生育酚与γ-谷维素复配后，羟基的波数为3 458 cm-1，与单独α-生育酚羟基波数3 460 cm-1相比较，有轻微地向低波数方向移动。当α-生育酚与植物甾醇复配后，羟基的波数为3 428 cm-1，与单独α-生育酚羟基处波数相比，向右移动了32 cm-1。当γ-谷维素与植物甾醇复配后，羟基波数为3 444 cm-1，而单独的γ-谷维素波数为3 454 cm-1，右移了10 cm-1。可见，3种脂质伴随物复配后体系内均存在氢键缔合，减少了羟基数目，降低供电子能力，从而削弱了与DPPH自由基反应能力。

3 结 论

乙酸乙酯非极性介质中，3种脂质伴随物α-生育酚(25～500 mg/kg)、γ-谷维素(250～10 000 mg/kg)和植物甾醇(250～10 000 mg/kg)两两复配后主要呈拮抗作用。500 mg/kgα-生育酚分别与10 000 mg/kgγ-谷维素、10 000 mg/kg植物甾醇复配后，呈现拮抗与加和作用，10 000 mg/kgγ-谷维素+10 000 mg/kg 植物甾醇协同度等于0.93,为拮抗作用；随后在上述复配含量范围内，通过动力学研究发现非极性介质复配体系的反应速率主要由体系中主抗氧化剂决定；同时采用傅里叶变换红外光谱仪检测复配脂质伴随物光谱，发现羟基右移，进而推测氢键的形成可能是导致3种脂质伴随物在乙酸乙酯中产生拮抗作用的原因。