CD4+T淋巴细胞/Th17在原发性胆汁性胆管炎患者外周血单个核细胞中的表达及意义

张小玉 张红梅 王雷 臧志栋

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一种自身免疫介导的慢性胆汁淤积性肝病，临床表现以血清抗线粒体抗体(AMA)阳性、IgM升高，组织病理学特征表现为小叶间胆管为中心的炎性细胞浸润、小胆管增生以及胆汁淤积，可慢性进展至肝纤维化，最终导致肝硬化。由于PBC 患者在发病初期缺乏明显的临床表现，大多数病人确诊时已到了病程晚期，治疗非常困难, 且PBC在我国的发病率呈逐年上升趋势，由此研究PBC的病因和发病机制，具有十分重要的意义[1]。

CD4+T淋巴细胞在PBC的致病过程中发挥着重要作用, 在不同细胞因子的刺激下可分化为不同亚群，包括辅助性T淋巴细胞Th1、Th2、Thl7及调节性T淋巴细胞(Treg) 等[2]，Th17是新发现的一种CD4+T淋巴细胞亚型，以分泌 IL-17为特征，在自身免疫性疾病中扮演着十分重要的角色[3]。 研究表明 Thl7细胞的分化与多种细胞因子密切相关，特别是IL-22、和IL-23等在诱导时起到了十分重要的作用[4]。本项目是研究CD4+T淋巴细胞/ Th17在原发性胆汁性胆管炎患者外周血单个核细胞中的表达，以初步探讨Thl7等细胞因子与PBC疾病的发生及疾病分期以及发展的关系。

资料与方法

一、病例选择

选择病例来自2018 年 7 月至 2019 年 7 月在南京市第二医院(南京市中医药大学附属南京医院)收治的患者，共24 例，其中女性 20例,男性 4 例，年龄35～60岁，平均年龄48.32岁。根据2009年美国肝病学会诊断标准和欧洲肝病学会诊断标准，诊断 PBC 需符合下列 3项诊断标准中的两项：(1)血清抗线粒体抗体(AMA)阳性；(2)血清碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)和(或)谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)水平升高；(3)肝脏典型病理改变。所有患者均排除了病毒性肝炎及药物性肝病等慢性肝脏疾病，同时征得病人本人同意后，签署知情同意书，所有患者给与肝穿刺活检，在腹部彩超的引导下行肝脏穿刺活检术，采用统一标准阅片，根据 Scheuer 评分系统对标本进行病理分期：Ⅰ期为小胆管炎期，Ⅱ期为细小胆管增生期，Ⅲ期为瘢痕期，Ⅳ期为肝硬化期。选取同期肝血管瘤切除标本的远端正常肝组织作为正常对照组，男性13例，女性11例，年龄32～60岁，平均年龄52.25岁，两组人员具有可比性。固定肝穿组织分别送南京中医药大学附属南京医院病理教研室一份，另一份南京中医药大学附属南京医院肝病研究所。

二、研究方法

(一)抽取研究对象外周静脉血5 mL，采用统一方法利用流式细胞仪检测患者血CD4+T淋巴细胞/ Th17细胞比值，血生化检测研究对象的肝功能，检测ALP、GGT等的数值。

(二)外周血单个核细胞的分离与培养：抽取患者外周静脉血5 mL，PBS稀释后，以血：Ficoll为1∶2的比例将血标本缓慢加入到Ficoll试剂中，400 g，离心30 min，吸取白色薄膜层到新的离心管中，用PBS洗两次后重悬计数。将分离的PBMC置于含有10 mL/dL FBS的1640培养基中培养24 h，不加刺激，收集上清进行细胞因子测定。

(三)细胞因子检测采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)检测样本血清中IL-23、IL-17的表达水平。ELISA试剂盒购自中国上海Arigo公司。实验操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

三、统计学处理

结 果

一、PBC组与对照组外周血及肝组织中 CD4+T淋巴细胞/ Th17的比较

表1显示，与HC组比较，PBC组外周血、肝组织中CD4+T淋巴细胞/ Th17值表达量明显高于HC组(P<0.05)，差异有统计学意义。

表1 PBC组与对照组肝组织中 CD4+T

与HC组比较，▲P<0.05

二、PBC组与对照组Th17 、IL-17、IL-23、等细胞因子浓度的比较

表2显示，与HC组比较，PBC组的Th17 、IL-17、IL-23、水平显著增高(P<0.05)，差异有统计学意义；与HC组比较， TGF-β表达水平也增高，差异有统计学意义(P<0.05)；

三、Th17 、IL-17、IL-23、TGF-β水平与ALT、TBil、GGT、ALP、AST的比较

血清Thl7相关细胞因子水平与各项临床及实验室指标的相关性分析如表3所示，与ALT、Tbil、GGT、ALP、AST、呈正相关(P<0.05)，差异有统计学意义。

四、CD4+T淋巴细胞/Th17及IL-17在PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBCⅢ-Ⅳ期中的比较

PBC患者PBCⅢ-Ⅳ期肝组织和外周血中CD4+T淋巴细胞/ Th17数值明显比PBC Ⅰ-Ⅱ期值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且IL-17表达在PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBCⅢ-Ⅳ期血清量差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表2 各组血清CD4+T相关细胞因子水平比较(±s)

与HC组比较，▲P<0.05

表3 各组血清Thl7相关细胞因子水平与临床及实验室指标相关性分析

▲：P<0.05：▲▲：P<0.01

表4 PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBC Ⅲ-Ⅳ期2组间比较(±s)

讨 论

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary choloangitis,PBC )是一种以肝脏为相对特异性免疫病理损伤器官的自身免疫性疾病，全球范围内40岁以上的女性发病率约为1/1 000，我国的流行病学调查结果表明，中年女性的发病率为155.8/10万[1],。PBC病理特点为进行性、非化脓性肝内小胆管炎，以瘙痒、黄疸为主要表现，到疾病晚期可产生腹水、消化道出血及肝性脑病、最后发展为肝衰竭。临床上90%～95%的PBC患者血清中可以检测出高滴度的抗线粒体抗体(AMA)， PBC发病机制至今尚未完全阐明，Harada等应用病原相关分子模式(PAMP)刺激胆管上皮细胞发现也能够产生Thl7诱导因子(IL-6、IL-1B、IL-23)[6-7]。最近一项研究：敲除IL-17A的小鼠胆管损害减轻、AMA抗体和IFN水平显著降低；敲除IL-22的PBC小鼠也出现了胆管损害减轻和IFN水平下降。另外，在PBC小鼠模型中IL-23/Thl7通路也促进了IL-12/IFN介导的免疫病理损伤过程[8-9]。

本研究表明PBC患者的肝组织和血清中CD4+T淋巴细胞/ Th17及细胞活化因子IL-17、IL-23水平与健康人群相比均显著升高，通过相关性分析，我们的研究表明PBC患者的ALP、GGT、IgG表达量明显提高，各血浆细胞因子IL-17、IL-23表达量与各项临床及实验室指标ALT、TBil、GGT、ALP、AST、呈正相关(P<0.05)，差异有统计学意义。外周血及肝组织中CD4+T淋巴细胞/ Th17及IL-17在PBC Ⅲ-Ⅳ期中的数值明显高于PBC I-Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)，这与众多的研究结果一致[10]，反映出PBC患者存在胆汁淤积、胆管堵塞以及不同程度的肝细胞损伤和肝功能下降的情况。表明CD4+T淋巴细胞尤其是辅助性T淋巴细胞Thl7参与了PBC的炎症反应过程，可能在PBC疾病过程中发挥了重要作用。

我们的研究结果提示PBC患者受损的门管区及外周血中存在大量的CD4+T淋巴细胞浸润，CD4+T淋巴细胞/ Th17、IL-17在PBC的发生过程中具有重要作用，CD4+T细胞的异常活化和增殖在PBC发病过程中起了十分重要的作用，参与其细胞因子介导的伴有AMA形成的自身免疫过程，我们期待在通过对PBC发生发展机制的研究过程中通过复杂的免疫学调控网络找到更多的方向和证据，为临床患者带来希望和健康保障。