3种检测方法在肿瘤患者侵袭性真菌病中的应用价值*

黄 刚,刘联斌,刘 弯,林 炜,李远香,刘春霞

江西省赣州市肿瘤医院检验科,江西赣州 341000

侵袭性真菌病是指真菌入侵人体组织或血液,经生长繁殖对机体组织、器官功能造成损害，并引发炎性反应的一种感染性疾病,其中以念珠菌为主的酵母样真菌和曲霉菌为主的丝状真菌引起的感染最为常见[1-2]。侵袭性真菌病常见于免疫功能低下人群,近年来,随着肿瘤患者手术和放化疗等治疗技术的广泛开展,患者受到真菌感染的发生率呈明显上升趋势,如何及时诊断并有效地治疗侵袭性真菌病受到越来越多的关注。目前,真菌检验技术主要包括传统的真菌涂片镜检和真菌培养、组织病理学检查、血清学检测、分子生物学技术和质谱技术[3]。在欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组(EORTC/IFICG)标准[4]、美国真菌病研究组(MSG)标准[5]、美国抗感染学会(IDSA)指南[6]、我国《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则(第四次修订版)》[7]中都提到(1,3)-β-D-葡聚糖检测(G试验)是临床诊断侵袭性真菌病的诊断标准之一。本研究对血清降钙素原(PCT)检测、G试验和荧光定量PCR技术在肿瘤患者侵袭性真菌病早期诊断中的价值进行了探讨,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年6月至2018年12月入住本院的合并真菌感染的肿瘤患者25例纳入真菌组,包括念珠菌感染13例,曲霉菌感染10例,毛霉菌感染2例,真菌感染诊断标准为放射学检查支持存在感染的部位,在无菌术下取得的标本,经培养结果呈阳性。真菌组纳入标准:符合《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则(第四次修订版)》[7]诊断标准。细菌感染患者25例纳入细菌组,包括革兰阴性菌感染16例,革兰阳性菌感染9例。另选择同期25例健康体检者纳入对照组。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 PCT检测采用飞测Ⅲplus仪器,试剂购自广州万孚生物技术有限公司；G试验采用ELX808鲎试验检测仪器,试剂购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；真菌荧光定量PCR检测采用ABI7500仪器,试剂购自广州达安有限公司。

1.3方法 按操作规程采集静脉血标本进行PCT检测及G试验,真菌组同时进行真菌实时荧光定量PCR检测。通过查找曲霉菌属、隐球菌属和真菌通用的基因序列,委托广州达安有限公司进行引物设计,采用ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行检测。反应程序为37 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s,55 ℃ 45 s,10个循环；94 ℃ 20 s,55℃ 45 s,30个循环。PCR检测以Ct值<30,且有较好的对数增长曲线为阳性标准。 血清PCT正常参考范围为<0.5 ng/mL,(1,3)-β-D-葡聚糖正常参考范围为<10 pg/mL,大于或等于参考值判断为阳性。

2 结 果

2.13组血清PCT、(1,3)-β-D-葡聚糖水平比较 真菌组血清PCT水平稍低于细菌组,差异无统计学意义(t=-3.93,P>0.05)；真菌组血清PCT水平明显高于对照组,差异有统计学意义(t=25.70,P<0.05)。真菌组(1,3)-β-D-葡聚糖水平明显高于细菌组及对照组,差异有统计学意义(t=10.85、15.01,P<0.05)。 见表1。

表13组血清PCT、(1,3)-β-D-葡聚糖水平比较

2.23种方法在侵袭性真菌病早期诊断中的价值比较 在真菌组中，实时荧光定量PCR检测的阳性率高于G试验和PCT检测,差异有统计学意义(χ2=4.15、22.22,P<0.05)；而G试验阳性率高于PCT检测,差异有统计学意义(χ2=9.74,P<0.05)。见表2。

表23种方法在侵袭性真菌病早期诊断中的价值比较

3 讨 论

肿瘤患者在接受化疗后,由于自身免疫力低下容易引起侵袭性真菌病。国内外流行病学研究显示,血液病及恶性肿瘤患者中侵袭性真菌病的发病率呈现上升趋势,且念珠菌和曲霉菌是侵袭性真菌病最主要的两种致病菌[8-10]。选择合适的检测方法和指标对于早期诊断和治疗侵袭性真菌病有重要价值。

真菌涂片镜检和真菌培养技术是传统的真菌检测方法,仍具有重要价值。但真菌涂片报告需要区分酵母相及菌丝相,并进行具体描述[11],由于实验室人员识别能力参差不齐,易造成假阴性。相对于真菌培养技术耗时较长,组织病理学检查取材不便,质谱技术检测仪器昂贵等原因,血清学检测和实时PCR技术已发展成熟,采集血液标本易于常规实验室开展。本研究发现,真菌组(1,3)-β-D-葡聚糖水平明显高于细菌组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(1,3)-β-D-葡聚糖可用于辅助侵袭性真菌病的早期诊断,这与国内大多文献报道一致[12-15]。本研究提示,真菌组实时荧光定量PCR检测阳性率高于PCT、(1,3)-β-D-葡聚糖检测。(1,3)-β-D-葡聚糖检测是侵袭性真菌病的诊断标准之一,但隐球菌、结核分枝杆菌引起的感染G试验为阴性或轻度升高[16]。PCR技术具有耗时短,污染少,灵敏度、特异度高,以及重复性好的特点[17-18],阳性率高于血清PCT和(1,3)-β-D-葡聚糖检测,在侵袭性真菌病的早期诊断中具有一定价值。

本研究证实了联合检测在侵袭性真菌病早期诊断中的重要价值,但仍需大样本量的研究来进一步证实。随着人工智能的不断发展,侵袭性真菌病早期诊断技术将更加快速、准确。