一种新型DNA纳米结构的构建与结晶

吕家臻， 黄 震

(四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都610065)

1 引 言

DNA不仅可以作为遗传信息的载体， 还可以作为纳米材料．核酸纳米材料在生物传感器、活细胞成像、生物递送系统等领域中得到了广泛地应用[1]．目前在药物递送系统中， 核酸纳米材料已经成为了不可或缺的一部分， 如DNA正面体可以用来递送核酸药物和小分子药物等[1]．19世纪80年代， Seeman 提出了分支DNA技术， 为二维和三维核酸纳米材料的构建奠定了基础[2]．分支DNA的灵感来源于生命体内的一些特殊的DNA结构， 如复制叉的三臂结构， Holliday的四臂结构[2]．DNA纳米材料的构建主要有三种方法：基于黏性末端的构建， 单链DNA的堆砌和DNA折纸术[3-4]．虽然， 构建DNA纳米材料的技术越来越成熟， 但是目前得到核酸纳米材料的结构大都没法精确测定， 主要是由于在高浓度条件下， DNA链容易聚集成高聚体的副产物而不是目标DNA纳米结构[5]．所以常用的DNA纳米结构检测方法是凝胶电泳分析和原子力显微镜(AFM)， 随着近年来冷冻电镜技术(cryo EM)的飞速发展， 一些尺寸较大的DNA纳米材料也可以用冷冻电镜来进行表征[6]．但是这些技术手段只能观察到DNA纳米材料的表面形貌， 没办法观察到DNA纳米材料的精确结构以及原子间的相互作用．只有真正了解了原子间的相互作用才能更好地理解DNA纳米结构的形成和应用， 包括更有效地设计DNA纳米结构．这样才能有利于在不影响DNA纳米结构的稳定性下设计合适的药物分子结合位点．而X射线晶体衍射法为DNA纳米材料的解析提供了一个强有力的手段[7]．

众所周知， 得到高质量的单晶和相位的确定一直是结构生物学中的两大难题[8-9]．硒核酸已经被许多实验证实在晶体生长和相位确定中具有很大的优势[10-11]．硒原子和氧原子属于同族元素， 具有相似的性质．硒原子通过取代氧原子可被引入核酸且对核酸结构几乎没有影响[12]．核苷酸中不同位置的硒修饰包括碱基和糖环都可以通过化学有机合成得到大量纯度较高的亚磷酰胺单体．得到的硒修饰的亚磷酰胺单体再通过DNA固相合成得到较大量的硒代核酸， 并可通过高效液相色谱(HPLC)纯化的得到纯度较高的硒核酸[10]．得到的硒核酸便可以用于DNA纳米结构生物学研究．为了提高该DNA纳米结构的晶体质量和对其相位的确定， 对该Holliday基序中的一条核酸链的进行硒代修饰， 得到了硒代修饰的DNA纳米结构， 同时也生长出了相应的高质量单晶．此外， 该DNA纳米结构容易生长成为较大的单晶， 有希望应用于中子衍射研究[13]．

2 材料与方法

2.1 材 料

天然的亚磷酰胺单体购于GenePharm公司．2SeT亚磷酰胺单体由硒核酸研究所提供．天然的DNA寡核苷酸(Nat-DNA oligos)购于生工公司.Nat-DNA oligos购于生工公司并采用HPLC纯化.

2.2 方 法

2.2.1 Nat-DNA oligos和2SeT-d DNA oligo Nat-DNA oligos和2SeT-d DNA oligo样品的质谱分析由生工公司提供．2SeT-d DNA oligo合成和纯化．采用DNA固相合成的方法， 从3′端向5′端化学合成得到大量的2SeT修饰的DNA oligo．将干燥过的2SeT亚磷酰胺单体和天然的pac-dA， dC， dT亚磷酰胺单体分别用溶解乙腈溶解；pac-dG在用溶解乙腈溶解的同时需要额外加入25%的无水甲苯， 剧烈震荡使其溶解．称取33 mg的universal-CPG beads于合成柱中， 设置好DNA合成仪的参数后， 输入要合成的2SeT修饰的DNA 序列 82SeT-d， 并选择不脱掉5′端的最后一个亚磷酰胺单体的DMTr， 开始合成2SeT修饰的DNA oligo， 合成过程中观察每一步亚磷酰胺单体脱掉5′保护基团DMTr时的颜色， 颜色的深浅反应合成效率的高低.合成结束后采用超温和脱保护的方法来纯2SeT修饰的DNA oligos．将上一步得到的载有DNA oligo的 beads转移到2 mL的离心管中， 向离心管加入1 mL的含有0.05 mol/L的甲醇溶液， 室温(25 ℃)反应过夜(12 h)， 此时DNA 已经从beads上断裂溶解到甲醇溶液中， 离心将上清液经0.22 μm的滤头转移到一个新的2 mL离心管中， 并用1 mL的超纯水涮洗beads 三次， 每次0.333 mL， 将三次涮洗后的超纯水也都经滤头转移到和装上清液的同一个离心管中， 混匀.将以得到的约2 mL的样品分成两份转移1 mL到另一个新的2 mL的离心管．用注射器的针头将上述两个装有1 mL样品的离心管盖戳空并用液氮冻实， 将其放入冷冻干燥机中冷冻干燥至体积到0.5 mL以下， 取出样品放入4 ℃冰箱， 用装有C18反向柱的HPLC纯化．在buffer A(20 mmol/L 三乙胺乙酸盐)， buffer C(20 mmol/L三乙胺乙酸盐， 50%乙腈)的梯度转换下， 大约条件中30%乙腈的时候， 带有DMTr的DNA oligos 被洗脱出来， 用50 mL的离心管收集样品， 将收集到的样品冷冻干燥至全干．用 1 mL的10%的乙酸， pH 4.0～4.5 分3次刷洗50 mL离心管， 将洗脱下来的约1 mL 的样品放在40 ℃下反应2～2.5 h 去掉DNA 5′端的保护基团DMTr．反应结束后， 调样品的pH≈7， 并用等体积的三氯甲烷萃取样品中去掉的DMTr 3次．将经萃取后的样品经过C18的脱盐柱除掉样品中的盐分， 最后浓缩得到大量较纯的2SeT修饰的DNA oligos．纯化得到的DNA序列信息和质谱分析数据见表1．

表1DNAoligos的序列信息和电喷雾质谱检测数据

Tab.1SequenceinformationandelectrosprayionizationmassspectrometrydataofDNAoligos

StrandsSequence (5′-3′)Calculated M/ZMeasured M/Z [M-H+]-sGAGCAGCCTGTACGGACATCA6 440.26 440.4mACACCGTACACCCGTACACCGT6 320.16 319.3aGCGCTACGGACATCA4 562.04 562.5bGCGCGTACACCGTA4 248.84 249.0cGAGCAGCCTGTAC3 959.63 960.0dTCTGATGTGGCTGC4 285.84 285.482SeT-dTCTGATG (2SeT) GGCTGC4 348.84 348.4

2.2.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制10×的TAE/Mg2+buffer: 400 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA, 200 mmol/L冰乙酸， 和125 mmol/L氯化镁， 调pH 8.0， 将10×的TAE/Mg2+buffer 稀释至1×用于电泳缓冲液．将各个DNA链稀释至30 μmol/L， 10 μL DNA三角形反应体系包括：3 μL a链， 3 μL s链， 1 μL m链， 2 μL ddH2O和1 μL 10×TAE/Mg2+buffer．10 μL DNA二聚体纳米结构反应体系包括：2 μL a链， 2 μL b链， 2 μL c链， 2 μL d链， 1 μL ddH2O和1 μL 10×TAE/Mg2+buffer．10 μL单链反应体系：3 μL单链， 6 μL ddH2O， 1 μL 10×TAE/Mg2+buffer．将上述反应体系置于95 ℃， 2 min, 让其自然冷却至室温．取上述10 μL反应体系中的2 μL加到配制好的12%的PAGE， 在冰水浴中或者4 ℃条件下150 V 电泳40 min．

2.2.3 Nat-DNA纳米结构和82SeT-d-DNA纳米结构晶体生长 用悬滴法来生长DNA纳米结构晶体， 5～10 μL的液滴包括：0.1 mmol/L DNA纳米结构， 30 mmol/L二甲基砷酸钠(pH 6.5)， 50 mmol/L氯化镁， 50 mmol/L硫酸铵， 5 mmol/L乙酸镁和25 mmol/L Tris (pH 8.5) ．液滴置于24孔板中， 加0.6 mL的硫酸铵作为池液， 在16 ℃培养箱中培养3～6 d即可得到天然的DNA纳米结构和2Se-dT修饰的DNA纳米结构晶体．

3 结果与分析

3.1 DNA纳米结构的构建

目前利用X-射线晶体衍射法解析出来的DNA纳米材料的晶体结构屈指可数．自组装DNA三角形是较早利用X-射线晶体衍射法解析出来的DNA纳米结构[14-16]．该DNA三角形利用Holliday基序作为拐角， 通过一条单链DNA将三条边固定在一起(图1A)．对DNA三角形进行改造， 将其拐角处的Holliday基序截断， 并引入黏性末端到该Holliday基序中(图1B)， 使其能够自组装成为一种DNA纳米结构， 该基序可能形成一种二聚体DNA纳米结构或是一种三聚体的DNA三角形结构(图1C， 图1D)．通过对该DNA纳米结构中的d链进行硒代修饰(图1E)， 来帮助其晶体的生长和结构解析中相位的确定， 希望能对该新型的DNA纳米结构进行结构解析， 以便发现该新型DNA纳米结构和该Holliday基序组装的三维结构， 从而更深入地认识DNA纳米材料的组装规律．

3.2 8-2SeT-d DNA oligo的纯化和质谱检测

利用HPLC来纯化5′端带有DMTr的2SeT-d DNA oligo．由于5′端带有DMTr的2SeT-d DNA oligo极性较5′端没有DMTr的DNA小， 可以利用C18的反向柱进行分离纯化， 用极性较大的水和极性较小的乙腈作为缓冲溶剂， 缓冲液在30 min内从15%的乙腈转变为40%的乙腈．所以5′端没有DMTr的DNA也就是合成反应中的非目的产物就会率先从C18反向柱中洗脱下来， 大概3～5 min被洗脱下来而．5′端带有DMTr的2SeT-d DNA oligos则会在更小的极性条件下(大概30%的乙腈)被洗脱下来．82SeT-d DNA oligo在19.4 min被洗脱下来(如图2A)， 最后纯化得到0.1～0.2 μmol的82SeT-d DNA oligo, 足以用于DNA三角形晶体生长实验．此外， 最后对82SeT-d DNA oligo进行电喷雾质谱(ESI-MS)检测来验证硒原子是否稳定存在于DNA oligo 中， 测得82SeT-d DNA oligo的荷质比为4 348.4 (如图2B， 表1)， 而通过计算得到的荷质比为4 348.8．可以认为成功合成了82SeT-d DNA oligo， 且纯度较高．

图1 DNA 纳米结构的构建

A.DNA三角形的序列和二级结构；B．将DNA三角形结构中Holliday基序截断并引入CGCG黏性末端；C．带有黏性末端的Holliday基序通过三次重复组装成为一个三聚体的DNA三角形结构；D．带有黏性末端的Holliday基序通过两次重复组装成一个二聚体的DNA纳米结构；E．2SeT 在d链中修饰的位置

Fig.1 Construction of DNA nanostructure

A.Secondary structure of DNA triangle；B．Holliday motifs in DNA triangle structure were truncated and introduced into CGCG sticky ends；C．Holliday motif with a sticky end is assembled into a triangular DNA structure by three repetitions；D．Holliday motif with a sticky end is assembled into a dimer DNA nanostructure by two repetitions；E．2SeT modification site in strand d

图 2 82SeT-d DNA oligos的HPLC纯化峰图和电喷雾质谱检测图Fig.2 HPLC purified peak map and electrospray mass spectrometric map of 82SeT-d DNA oligos

图 3 DNA 三角形和DNA纳米结构的非变性凝胶电泳

1：DNA Ladder；2：d链；3：s链；4：m链；5：d链+s链+m链， 即DNA三角形；6：a链；7：b链；8：c链；9：a链+b链+c链+d链， 即DNA二聚体纳米结构；10：DNA三角形

Fig. 3 Nondenaturing gel electrophoresis of DNA triangular and DNA nanostructures

1：20 bp DNA Ladder；2：Strand d；3：Strand s；4：Strand m；5：Strand d + Strand s + Strand m， namely DNA triangle；6：Strand a；7：Strand b；8：Strand c；9：Strand a + Strand b + Strand c + Strand d， namely DNA dimer nanostructure；10：DNA triangle

3.3 DNA三角形和DNA二聚体纳米结构的凝胶电泳分析

用酶标仪对组成DNA三角形的三条链d， s， m和组成DNA二聚体纳米结构的四条链a， b， c， d进行定量， 将它们都稀释到30 μmol/L, 将d∶s∶m 按3∶3∶1， a∶b∶c∶d按1∶1∶1∶1混合反应， 并加入退火缓冲液从95 ℃退火至室温后， 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 且凝胶电泳要在低温下进行．凝胶电泳检测的DNA三角形条带和DNA二聚体纳米结构条带如(图3)， 可以看出， DNA三角形条带的凝胶迁移速率比DNA二聚体纳米结构的迁移速率要小， 这说明角单元并没有组装成一个更大的三聚体DNA三角形， 而是形成了一个更小的聚合物可能是二聚体的DNA纳米结构也可能只是一个DNA单体．DNA三角形的大小是126 nt， DNA二聚体纳米结构的大小为112 nt， 而该DNA单体则是56 nt．从DNA三角形凝胶电泳条带和Marker的位置来分析， 该角单元应该是组装成为了一个112 nt 的DNA二聚体纳米结构， 而不是一个56 nt 的DNA单体结构．

3.4 天然的DNA二聚体纳米结构和硒代的DNA二聚体纳米结构的结晶

对Nat-DNA二聚体纳米结构和82SeT-d-DNA二聚体纳米结构进行晶体生长研究．将Nat-DNA二聚体纳米结构和82SeT-d-DNA二聚体纳米结构分别和结晶缓冲液混匀后， 用悬滴法在16 ℃培养箱中培养3～6 d， 即可得到相应的DNA二聚体纳米结构晶体．结果发现， 不管是Nat-DNA二聚体纳米结构还是82SeT-d-DNA二聚体纳米结构都会生长成质量较高的立体晶体(图4)．方块状的晶体大小都在200 μm左右， 立体性较好而且晶体表面较光整， 能够用于x-射线晶体衍射进行结构测定， 并有希望得到较高分辨率的晶体结构；同时得到了2SeT-DNA二聚体纳米结构晶体， 可以很容易进行相位确定， 帮助DNA二聚体纳米结构的结构解析．

图 4 Nat-DNA二聚体纳米结构和2SeT-DNA二聚体纳米结构

4 讨 论

以前的实验研究表明硒原子在一定程度上能够帮助晶体生长和得到高分辨率的晶体结构[10]．硒原子具有比氧原子更强的非极性， 从而在晶体生长的过程中能够把周围的一些水分子给挤出结构外， 从而使核酸结构的堆积的更加紧密， 能增加分子之间的相互作用， 帮助晶体的生长[11]．通过合理的引入硒原子到DNA二聚体纳米结构中也得了质量较高的单晶， 有希望获得高分辨率的DNA纳米结构．本文通过对DNA三角形进行改造， 并合理的引入黏性末端到双交叉DNA Holliday基序上， 成功构建了一种新型的DNA二聚体纳米结构， 为DNA纳米结构的构建提供一种很好的策略．

总之， 通过对DNA三角形的改造成功地构建了一种新型DNA纳米结构．该DNA二聚体纳米结构的晶体生长实验中， 发现该DNA二聚体纳米结构能够生长成单晶， 说明该结构能够以较高的纯度稳定存在．从凝胶电泳的分析中发现， 该DNA纳米结构甚至比之前的DNA三角形产率更高， 结构可能更稳定， 更有利于解析得到高分辨的晶体结构， 以便发现该新型DNA纳米二聚体结构和该Holliday基序组装的三维结构， 从而更深入地认识DNA纳米材料的组装规律， 为以后的DNA纳米结构的设计和优化奠定结构信息基础．此外， 通过硒原子的引入可以帮助得到更多的高质量核酸晶体以及核酸的结构解析， 为DNA纳米结构领域提供更多的信息， 帮助优化并完善DNA纳米结构的设计．