破骨细胞融合相关分子的研究进展

邹斌华，郑洁煌，李晓娟

在正常破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间，存在相互制约的骨重建维持机制，这一机制保持骨组织不断更新。骨重建过程受激素及其他局部因素的调节，其重要的核心细胞——破骨细胞是体内唯一负责骨吸收的细胞，破骨细胞活化和细胞融合是其行使骨吸收功能的关键过程[1]。研究表明，在骨质疏松、类风湿性关节炎、肿瘤等诱导的骨破坏中，均存在破骨细胞过度活化[2-5]。破骨细胞被过度激活后加速骨质吸收，导致骨丢失，引发反应性骨増生和骨折，进而引起疼痛，造成残疾，严重影响患者的生活质量[6-7]。

目前骨质疏松、类风湿性关节炎等破骨细胞相关骨破坏疾病患病人群庞大；而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、白血病等恶性肿瘤疾病中，骨转移造成的骨破坏也十分常见[8-11]。在破骨细胞分化过程中，破骨前体细胞（osteoclast precursor cell，OPC）发生细胞-细胞融合是形成多核破骨细胞的关键阶段。因此，影响破骨细胞融合的形成或许是靶向调控破骨细胞生成药物研发的一个新方向，对破骨细胞融合机制的深入研究，将为预防和治疗骨质疏松等骨破坏相关疾病提供新的方法和思路。本文对破骨细胞融合相关分子的研究进展进行文献复习，现综述如下。

1 破骨细胞融合过程

破骨细胞融合过程受时间和空间高度调控，蛋白质相互作用和修饰、特殊基因途径、激素、多种细胞因子及理化因子等因素均可对其融合过程造成影响。在多种因素刺激下，OPC表达融合相关分子后形成巨大的多核细胞，并最终分化为具有强骨吸收活性的成熟破骨细胞[12-13]。

目前研究较多的融合相关分子包括树突状细胞特异性跨膜蛋白（dendritic cells-specific transmembrane protein，DC-STAMP）、破骨细胞多次跨膜蛋白（osteoclast-stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP）、ATP6vOd2、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、CD44、CD47、CD9、轻链钙调蛋白结合蛋白（light-chain caldesmon，L-CaD）等。破骨细胞融合相关分子的缺失会导致多核破骨细胞生成减少，如DC-STAMP基因敲除小鼠出现骨硬化症[14]、OC-STAMP缺陷小鼠出现破骨细胞及破骨细胞融合缺失等[15]。融合后的多核破骨细胞为极性细胞，可特化出许多特殊骨架结构，如封闭环、皱褶缘等，参与骨稳态的调节[16]。

2 破骨细胞融合的激活和调节机制

破骨细胞融合过程需要多种融合分子及信号通路的传导，而各种融合相关分子及信号通路之间相互作用，导致破骨细胞融合调节机制较为复杂。目前已知核因子кB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-к B ligand，RANKL）介导的信号通路的激活，能诱导OPC融合形成巨大的多核破骨细胞[17]，而对破骨细胞融合调节机制研究较多的主要是微小RNA（micro RNA，miRNA）调控机制。

2.1 RANKL信号通路激活机制

RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF）是破骨细胞生成的必需因子。在破骨细胞生成过程中，RANK与RANKL结合，募集衔接分子TRAF6，而后激活蛋白激酶MAPK（ERK、JNK和p38）和核因子（nuclear factor，NF）-кB、激活蛋白（activator protein，AP）-1，上调活化T细胞核因子 c1（nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1）早期表达；此外，RANKL信号通路可协同免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）共刺激信号通路，激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）-γ2的磷酸化并引发钙离子振荡，促进NFATc1大量生成，增加破骨相关基因的表达，从而调节破骨细胞的分化、融合，促进骨吸收过程[18-22]。

2.2 miRNA调控机制

miRNA是一种调节性的内源性非编码小分子RNA。有研究表明，miRNA能参与调节破骨细胞的生成，从而影响骨质疏松等骨代谢疾病的相关进程[23]。实验证明，针对不同融合分子设计的RNA干扰分子，能在一定程度上抑制破骨细胞的融合：miR-30a通过靶向融合分子DC-STAMP直接调节破骨细胞的融合过程[24]；miR-7b-5p在破骨细胞分化和融合过程中直接靶向作用DCSTAMP，抑制NFATc1和c-Fos信号传导，从而抑制成熟破骨细胞的细胞-细胞间融合形成等[25]；miR-1224也对破骨细胞形成具有重要作用，过表达miR-1224可导致c-Fos和NFATc1显著增加，融合型破骨细胞数量也随之提高[26]。

3 破骨细胞融合相关因子

3.1 DC-STAMP和OC-STAMP

3.1.1 DC-STAMP最早在人树突状细胞中发现的DC-STAMP是一种7次跨膜蛋白[27]，在物种间高度保守，人与鼠DC-STAMP同源性髙达90%[28]。

3.1.1.1 DC-STAMP在破骨细胞融合中的调控机制 目前普遍认为，DC-STAMP是破骨细胞融合过程的主要调控者[29-30]。在破骨细胞形成过程中，RANKL可诱导DC-STAMP表达升高，进而促进OPC脂双层之间发生细胞-细胞融合，形成多核破骨细胞[29,31]。Yagi等[14]研究发现，在 RANKL 和M-CSF存在的条件下，DC-STAMP缺陷细胞不能产生多核破骨细胞，DC-STAMP基因敲除小鼠因缺乏功能性多核破骨细胞而表现出骨硬化症表型；但采用逆转录病毒过表达DC-STAMP基因后，OPC融合增加。Iwasaki等[32]的研究亦证实，DC-STAMP转基因小鼠破骨细胞融合、骨吸收增加，骨量降低。

Chiu等[27]发现，DC-STAMP细胞其细胞质尾部存在一个免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），可参与细胞信号的传导过程。Yagi等[33]的研究结果显示，NFATc1和c-Fos是DC-STAMP表达和破骨细胞融合过程中不可或缺的分子。过表达DC-STAMP可逆转DC-STAMP缺陷细胞中NFATc1表达降低，且DC-STAMP细胞质尾部的ITIM可借助调控细胞内钙离子浓度来调节破骨细胞的分化融合，人们推测DC-STAMP可能通过激活NFATc1-Ca2+轴来促进破骨细胞的生成[34-36]。

目前有关DC-STAMP影响破骨细胞生成的分子机制取得重大进展，但其配体研究未见报道。确定DC-STAMP配体，未来可能突破对破骨细胞分化和活化的认识，开辟破骨细胞生成研究新思路。

3.1.1.2 DC-STAMP与骨破坏 DC-STAMP与骨破坏疾病相关。在Paget's病患者中鉴定出DCSTAMP细胞质尾部的易感突变区[37]，编码DCSTAMP的基因TM7SF4发生基因突变[38-39]。而在牙周炎患者牙龈组织中，DC-STAMP基因表达明显上调；对牙周炎小鼠局部及腹腔注射抗DC-STAMP单克隆抗体，多核破骨细胞生成和牙槽中骨吸收明显减少，表明DC-STAMP在牙周炎骨丢失中具有重要作用[30]。正因为DC-STAMP与骨破坏疾病高度相关，使其可能成为抗骨破坏疾病药物的作用靶点。

3.1.2 OC-STAMP OC-STAMP是一类6次跨膜蛋白，在破骨细胞生成过程中可被RANKL诱导表达[15,40]。 Yang等[41]运用OC-STAMP-siRNA及OCSTAMP抗体抑制OC-STAMP表达后，多核破骨细胞生成显著减少；但在体外过表达OC-STAMP基因后，RAW264.7细胞融合的抑制效应被抵消。亦有学者发现，OC-STAMP缺陷小鼠表现出破骨细胞完全缺乏和细胞-细胞融合缺失[15]；Ishii等[42]的研究结果也证实，OC-STAMP缺陷小鼠牙周炎较WT小鼠骨吸收减少，使用抗OC-STAMP抗体能抑制体外多核破骨细胞的生成。

OC-STAMP和DC-STAMP除结构相似外，还具有很多共同特征。在RANKL刺激下，两种蛋白在破骨细胞中的表达量均明显升高；均能促进RANKL刺激下OPC间的融合；在加入抗体或使用siRNA进行基因干扰后都能抑制破骨细胞生成过程中的细胞融合，而对其进行过表达后，被siRNA抑制的破骨细胞融合消失均可恢复。需要强调的是，尽管DC-STAMP和OC-STAMP对破骨细胞生成至关重要，但它们是两种不同类型的特异性蛋白，不可相互代替：DC-STAMP的缺失不能被OC-STAMP的过表达所补充，反之亦然[15]。DC-STAMP和OC-STAMP如何参与细胞-细胞融合过程中脂质双分子膜的分裂和再封闭，以及它们在破骨细胞生成信号级联中的相互作用，均有待进一步的深入研究。

3.2 CD

白细胞分化抗原是不同阶段、不同类型白细胞膜上的表面标记，主要是膜蛋白或膜糖蛋白。其可作为表面标志用于细胞分离与鉴定，也同时参与细胞生长、迁移、分化、成熟等生理过程的调节。在破骨细胞融合过程中，CD44、CD47、CD9等扮演了重要角色。

3.2.1 CD47整合素相关蛋白（IAP/CD47）与巨噬细胞之间的融合有关，主要在具有很少核的OPC细胞/破骨细胞表面表达[43]。CD47和信号调节蛋白α（signal regulatory protein alpha，SIRPa）之间的相互作用能调节细胞迁移与吞噬、细胞因子产生和巨噬细胞融合等过程[44]。

与野生型细胞相比，CD47缺陷小鼠OPC诱导生成的多核破骨细胞数量和骨吸收功能显著降低[44]。而与野生型小鼠对比，CD47缺陷小鼠破骨细胞数量减少、骨矿物质密度降低；对CD47缺陷小鼠骨髓基质细胞中破骨细胞成熟标志物的测定则表明，破骨细胞融合功能出现缺陷[45]。

在加入CD47抗体后，小鼠破骨细胞之间的融合受到抑制，提示功能性破骨细胞的分化需要CD47的参与[45]。CD47缺陷小鼠明显的骨骼表型及CD47体外效应表明，CD47在OPC融合生成多核破骨细胞过程中具有不可或缺的作用[44-45]，但其介导的具体信号通路还需要进一步研究。

3.2.2 CD9 CD9是一种4次跨膜糖蛋白，可在多种细胞类型中表达，参与调节配子膜融合、肌肉细胞融合、有髓轴突形成和吞噬细胞多核化等细胞运动和细胞融合过程。在RANKL刺激下，RAW264.7细胞表面CD9表达显著增加；加入抗CD9抗体及siRNA靶向抑制CD9功能后，多核破骨细胞样细胞明显减少，破骨细胞融合受到抑制；而过表达CD9能促进破骨细胞自融合。此外，在卵巢切除引起的骨质疏松小鼠模型中，多核破骨细胞表面发现大量CD9的表达[46]。

现有研究表明，细胞膜上的脂筏为蛋白之间的相互作用和构象转变提供有利场所，在破骨细胞融合的过程中，其可通过共聚效应，促进促融合蛋白之间的相互作用，并将其聚集至肌动蛋白细胞骨架上，从而正向调控破骨细胞融合；破坏脂筏功能可明显抑制多核破骨细胞的形成[46]。Ishii等[46]、Lee等[47]通过骨组织免疫组化研究，证实CD9定位于不溶性脂筏微区，从而推测CD9作为重要的融合相关分子之一，可能通过细胞膜上的脂筏参与破骨细胞之间的融合。

3.2.3 CD44单核巨噬细胞谱系细胞具有黏附、相互融合并分化成破骨细胞的能力，作为一种在造血细胞中发挥重要作用的膜糖蛋白，CD44通过介导细胞-细胞之间的相互作用来调控组织中巨噬细胞的单核状态。体内外证据表明，巨噬细胞在细胞-细胞间的黏附/融合开始时，表面CD44表达出现短暂性升高，加入CD44配体后，多核细胞形成减少，由此认为，CD44及其假定的同源细胞表面配体可能是参与细胞-细胞相互作用导致融合的潜在成员之一[48]。

3.3 ATP6v0d2

在RANKL诱导下，液泡（H+）ATP酶（v-ATPase）v0结构域的d2异构体（ATP6v0d2）在破骨细胞中高度表达。Lee等[49]发现，ATP6v0d2缺陷小鼠OPC融合明显降低；与WT小鼠相比，ATP6v0d2基因缺陷小鼠骨髓腔空间减少、骨量显著增加，多核破骨细胞数量大大减少，但抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色阳性单核细胞的数量略有增加；将ATP6v0d2缺陷OPC与野生型OPC混合培养，发现两种细胞发生融合。这些证据表明，ATP6v0d2可能通过参与激活破骨细胞融合影响其成熟进程。

Chen等[50]发现，ATP6v0d2基因缺陷小鼠中成骨细胞生成和骨形成明显增加，而成骨细胞分化和分化相关基因表达没有发生改变，作者推测造成这一结果的原因可能是破骨细胞或其前体细胞改变后产生能正向调控成骨细胞生成的细胞外因子，进而提出ATP6v0d2可成为具有潜力的骨破坏治疗药物靶标。此外，ATP6v0d2能同时调节破骨细胞融合和成骨细胞骨形成，提示可通过靶向调节单个基因，在抑制破骨细胞成熟的同时诱导骨形成[49,51-52]。

3.4 E-钙黏蛋白

上皮细胞表达的钙离子依赖Ⅰ型跨膜糖蛋白——E-钙黏蛋白，在细胞黏附、细胞间稳定性和细胞运动中起重要作用[53-54]。在RANKL诱导的破骨细胞中，E-钙黏蛋白表达显著增加，而N-钙黏蛋白或P-钙黏蛋白则无此改变。Fiorino和Harrison[55]的研究结果显示，在体外，随TRAP染色阳性多核破骨细胞的增加，E-钙黏蛋白表达相应升高；在破骨细胞发生融合前采用E-钙黏蛋白中和抗体拮抗后，破骨前体RAW264.7细胞中TRAP、组织蛋白酶K、DC-STAMP和NFATc1的基因表达受到抑制，多核破骨细胞的生成明显减少；而在RAW264.7细胞中过表达E-钙黏蛋白后，多核破骨细胞的生成及NFATc1核转位均增加，提示其在影响破骨细胞融合的同时，能调节破骨细胞的骨吸收功能。但涉及E-钙黏蛋白调节的具体信号通路，目前知之甚少。

3.5 L-CaD

肌动蛋白细胞骨架重塑在骨吸收过程可能起到举足轻重的作用，骨锚固和基质降解的密封区就是由肌动蛋白细胞骨架重塑而成。L-CaD在调节肌动蛋白细胞骨架重塑中扮演重要角色，能够稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白ATP酶活性，从而保护肌动蛋白丝免受切割蛋白（如凝溶胶蛋白）的影响[56]。

Liou等[57]研究发现，在RANKL刺激的RAW264.7细胞中，L-CaD表达增加。Chan等[56]的研究结果亦表明，将L-CaD基因沉默，OPC融合减少，而对其过表达后，OPC融合增加；此外，L-CaD在OPC周围形成肌动蛋白环结构，改变细胞扩散和细胞表面黏附力的机械性质，促进其融合成多核破骨细胞。

有趣的是，在破骨前体细胞中表达的L-CaD可发生磷酸化，而L-CaD的表达水平和磷酸化程度均能影响RANKL诱导的破骨细胞分化：去磷酸化L-CaD的增加可促进RANKL诱导的破骨细胞融合，而磷酸化L-CaD增加则可抑制破骨细胞融合。这些研究均表明，L-CaD在促进RANKL诱导的破骨细胞融合过程中具有一定意义[56,58]。

3.6 其他融合相关分子

Meltrin-α、Pcdh7、dynamin、syncytin-1等均可参与破骨细胞融合过程的调控。Meltrin-α是一种融合型蛋白，可参与多核巨细胞及破骨细胞的形成[58]。在RANKL刺激下，破骨细胞中Pcdh7基因表达增加，抑制其基因表达后，破骨细胞融合受到抑制，融合相关基因DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6v0d2的表达也同时降低，表明Pcdh7通过促进细胞-细胞融合，在破骨细胞生成中发挥作用[59]。亦有学者发现，在早期单核OPC融合过程中，dynamin和DC-STAMP可能参与OPC的融合过程，其表达均有所增加[60-61]。此外，在破骨细胞分化过程中，syncytin-1基因和蛋白表达明显上升，但syncytin-1特异性参与破骨细胞融合，并不影响骨吸收[62]。

4 骨破坏疾病靶向治疗思路

目前直接靶向调节破骨细胞分化治疗骨破坏相关疾病的上市药物主要是RANKL单克隆抗体，其能抑制经典RANKL信号通路，阻止破骨细胞的分化和成熟[63]。然而，破骨细胞在不同分化阶段有着不同的作用和功能[64-65]，比如OPC在成血管过程中发挥关键作用，精准靶控破骨细胞分化过程中的某一个具体阶段，如破骨细胞融合过程，有助于减少破骨细胞靶向药物的不良反应，提高治疗效果，为破骨细胞相关骨破坏疾病制定理想的治疗策略。比如，使用抗DC-STAMP单克隆抗体对结扎性牙周炎小鼠进行腹腔和局部注射，小鼠牙槽骨丢失均减少；但牙周炎小鼠牙龈组织中肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和RANKL表达升高未受抑制，也就是说，采用针对DC-STAMP的新型治疗方案在抑制小鼠牙周炎局部骨丢失的同时，并不影响小鼠本身对口腔细菌的适应性免疫，是一种较为合理的治疗手段[30]。此外，许多恶性肿瘤通过诱导RANKL依赖及非依赖性通路促进破骨细胞生成，导致骨破坏，此时抑制破骨细胞生成中必须经历的细胞融合过程，也比单纯抑制经典RANKL依赖性信号通路更加有效。

目前对于破骨细胞融合相关的信号通路及调节分子的研究较少。尽管如此，通过RNA干扰技术，利用融合相关分子的特性设计miRNA，进而靶向调节破骨细胞的融合和骨吸收，已引起研究者的广泛关注。人们根据DC-STAMP结构设计能抑制多核破骨细胞生成的miR-30a、miR-7b-5p等；融合相关蛋白多位于细胞膜，DC-STAMP、OCSTAMP、CD47、CD9、E-钙黏蛋白等单克隆抗体均能在体外抑制多核破骨细胞的形成，具有抗体药物的研发基础；此外，破骨细胞生成后期——细胞融合阶段对破骨细胞生成的关键作用，提示其相关调节分子极有可能成为破骨细胞生成抑制剂的作用靶点，目前也逐渐成为业界的研究热点之一。

5 小结

骨组织中各种细胞的协同作用决定了骨重建的动态平衡，破骨细胞一旦被过度激活，将导致骨破坏疾病的发生。破骨细胞融合过程对于破骨细胞生成和骨破坏至关重要，而靶向调控影响破骨细胞融合的分子如DC-STAMP、OC-STAMP、白细胞分化抗原、ATP6vOd2、E-钙黏蛋白、L-CaD等分子是探究破骨细胞相关疾病治疗的新思路，然而现今对于破骨细胞融合相关分子的研究仍然较少。本文对影响破骨细胞融合相关分子进行综述，旨在为破骨细胞相关疾病的预防和治疗提供参考。今后工作的方向之一就是深入研究破骨细胞融合相关信号通路，为研发骨质疏松、炎症性骨破坏和肿瘤转移诱导骨破坏的靶向药物提供新的思路和方向。