一株产细菌素细菌CGMCC 6624分离鉴定及其生物学特性

贾丽艳 高娟娟 荆 旭 田宇敏 王 愈 郝 林

（山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷 030801）

随着人们食品健康意识的增强，绿色食品防腐剂受到越来越多的关注。细菌素作为天然食品防腐剂已成为研究热点[1]。细菌素（Bacteriocin）是由某些细菌通过核糖体合成，基因编码的一类具有抗菌活性的蛋白质，抗菌范围不仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性[2-3]。因其高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物相容性等优点，作为绿色生物防腐剂在农产品和其它食品的保藏和农作物安全生产中倍受关注[4]。考虑到细菌素产生菌及细菌素的安全性，到目前为止，只有乳酸菌产生的细菌素作为绿色防腐剂应用于食品行业[5]。然而，乳酸菌细菌素的理化及生物学特性又限制了其广泛应用。新型广谱的绿色防腐剂有待开发。

从安全的发酵食品中分离得到的食品级微生物将是开发新的食品级生物防腐剂的最好来源。山西老陈醋已有几千年的食用历史，食用安全性好。醋醅中栖息着多种微生物，如醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等，它们共同发酵生产出独居特色的山西老陈醋。目前研究主要集中在陈醋产酸及风味物质方面的研究，而对菌株在发酵过程中的拮抗性及产抑菌物质菌株对山西陈醋的形成和保藏方面功能研究较少[6-7]。本文从山西陈醋醋醅中分离筛选产抑菌物质的细菌，对获得的一株产广谱抑菌物质的细菌进行分类鉴定及生物学特性研究，为有效利用醋醅中微生物资源，开发研制产广谱、绿色生物防腐剂的微生态制剂及抑菌物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及材料 筛选材料：山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅。

指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus sp.）、芽孢杆菌SH108（Bacillus sp.SH 108），山西农业大学食品科学与工程学院保藏。

1.1.2 主要试剂 过氧化氢酶 （2 000～5 000 U/mg），美国Sigma公司；蛋白酶 K（2 000～5 000 U/mg），北京solarbio公司；DNA快速抽提试剂盒（细菌），上海生工生物工程有限公司；其它化学试剂均为常规试剂。

1.1.3 培养基 固体培养基：牛肉膏基础培养基[8]。

种子培养液及发酵培养液：葡萄糖1 g，酵母浸膏 1 g，蒸馏水 100 mL[9]。

指示菌生长培养基：LB培养基[8]。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离 采用倍比稀释平板涂布法对新鲜醋醅中细菌进行分离筛选。取10 g新鲜醋醅，置于装有90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡30 min，静置5 min。制备10-2到10-6的系列稀释液，取100 μL涂布固体培养基平板，并置于30℃培养箱中培养48 h。待单菌落出现后，划线法转接至斜面固体培养基培养后4℃保藏[10]。

1.2.2 产高效抑菌物质菌株的筛选 采用双层牛津杯法[11-12]。

1.2.3 发酵液酸抑菌排除试验 向两个小烧杯中加入适量蒸馏水，用36%乳酸和80%乙酸分别调节蒸馏水的pH，使其pH与产抑菌物质菌株发酵液的pH相同。取200 μL配置好的乳酸溶液、乙酸溶液于牛津杯中做抑菌试验，指示菌为芽孢杆菌SH108。

1.2.4 发酵液过氧化氢抑菌排除试验 采用过氧化氢酶排除过氧化氢法[13]处理发酵液。取去过氧化氢发酵上清液做抑菌试验，指示菌为芽孢杆菌SH108。

1.2.5 发酵液蛋白类抑菌物质定性试验 采用蛋白酶消化法[14]处理去过氧化氢发酵液。取蛋白酶消化后的发酵上清液做抑菌试验，指示菌为芽孢杆菌SH108。

1.2.6 菌株对蛋白类抑菌物质的免疫性试验 取200μL过氧化氢酶处理后的发酵上清液，做牛津杯抑菌试验。产抑菌物质菌株为指示菌，指示菌为芽孢杆菌SH108。

1.2.7 菌株生长和蛋白类抑菌物质生成曲线的构建 采用发酵用培养液培养产抑菌物质菌株，每间隔6 h测定发酵液的吸光值（OD600），同时，通过牛津杯法测定去过氧化氢发酵液的抑菌活性。指示菌为芽孢杆菌SH108。根据结果构建菌株生长曲线及蛋白类抑菌物质生成曲线。

1.2.8 菌株的鉴定

1.2.8.1 形态学观察及理化特性分析 理化性质及形态学分类：按照文献[9-10]做形态与生理生化分析。

1.2.8.2 16S rDNA序列系统发育分析 采用上海生工生物工程有限公司生产的基因组DNA快速抽提试剂盒 （细菌）提取待测指示菌的基因组DNA。采用扩增细菌16S rDNA 的通用引物（正向引物27 F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物 1512R：ACGGCTACCTTGTTACGACT）对细菌基因组DNA进行PCR扩增。获得的PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后送上海生工生物工程有限公司测序。测序完成后，将得到的序列登陆http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank 进行 BLAST，选取数据库中有代表性的菌株16S rDNA，采用clustalx1.83软件的Multiple Sequence Alignment程序进行同源性序列比对；采用MEGA5.05软件，以邻接法 （Neighbour-joining）构建系统发育树（Bootstrap=1 000）[9]。

1.2.9 菌株生物学特性研究

1.2.9.1 乙醇含量对菌株生物量的影响 将菌株接种于乙醇含量为0%，2%，4%，6%，8%和10%的发酵培养液中，30℃条件下培养48 h后分别测定OD600值。

1.2.9.2 温度对菌株生物量的影响 将待测菌株接种于发酵培养液中，分别在 30，35，40，45，50℃条件下培养48 h后，分别测定OD600值。

1.2.9.3 pH值对菌株生物量的影响 将待测菌种接种于初始 pH 值分别为 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的发酵培养液中，30℃条件下培养24 h后分别测定OD600。

2 结果与讨论

2.1 产广谱抑菌物质菌株的筛选

通过牛津杯法筛选醋醅中产抑菌物质菌株。结果发现1株细菌对革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌及芽孢杆菌具有抑制作用。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理 中 心 （China General Microbiological Culture Collection Center），编号 CGMCC6624。

2.2 酸抑菌排除试验

图1 细菌CGMCC6624抑菌性Fig.1 The antibacterial property of CGMCC6624

细菌CGMCC 6624发酵液pH为6。分别配制pH 6的乳酸溶液和乙酸溶液做牛津杯抑菌试验。由图2可知，含有pH 6的乳酸溶液、乙酸溶液的牛津杯周围无抑菌圈出现，表明pH 6的乳酸溶液、乙酸溶液无抑菌性，由此可以排除发酵液中酸抑制指示菌生长的可能。

2.3 过氧化氢抑菌排除试验

细菌CGMCC 6624发酵液经过氧化氢酶消化后，抑菌圈略有变小（图3），表明发酵液中含有过氧化氢。过氧化氢的存在，可抑制细菌的生长。但是，过氧化氢酶消化后，抑菌圈没有完全消失，表明发酵液中除过氧化氢外，还有其它物质可以抑制指示菌的生长。

图2 酸抑菌排除试验Fig.2 Testing of excluding the effects of organic acids

2.4 蛋白酶对抑菌物质的影响

细菌CGMCC 6624发酵液经过氧化酶处理后，用蛋白酶K（proteinase K）水解发酵液，结果显示发酵液经蛋白酶K水解后抑菌圈完全消失 （图4），表明发酵液中除过氧化氢外，还有蛋白类抑菌物质存在。

2.5 细菌CGMCC 6624对蛋白类抑菌物质的免疫性

去过氧化氢发酵液在含有指示菌CGMCC 6624的培养基上不能形成抑菌圈，表明细菌CGMCC 6624对其发酵液中的抑菌蛋白具有自身免疫性。

图3 过氧化氢抑菌排除试验Fig.3 Testing of excluding the effects of H2O2

2.6 抑菌蛋白的生成与细菌CGMCC 6624生长的关系

图4 蛋白酶对抑菌物质的影响Fig.4 Effect on of proteinase to antibacterial material

图6 细菌CGMCC 6624生长及抑菌蛋白生成曲线Fig.6 Curves on Growth of CGMCC 6624 and production of antimicrobial protein

发酵时间对细菌CGMCC 6624分泌的抑菌蛋白有很大的影响 （图6）。随着细菌CGMCC 6624生长和繁殖，抑菌蛋白的产生逐渐增多，在培养48 h左右达到最大；随着时间的推移，抑菌活性又逐渐减小，表明培养后期蛋白抑菌活性下降，推测抑菌蛋白被细菌分泌的蛋白酶酶解或者是被菌体表面吸附沉淀[16]。微生物在其生命活动过程中，能合成各种各样的代谢产物。依据代谢产物与微生物自身生长的关系，代谢产物可以分为初级代谢产物和次级代谢产物。发酵产物是初级代谢产物，产物形成与菌体生长分不开，呈一定正相关；次级代谢产物则相反，与菌株的生长相比具有一定的滞后性[15]。由此可以推测抑菌蛋白为细菌CGMCC 6624的初级代谢产物。细菌素是由细菌产生的蛋白或多肽类初级代谢产物[1]。细菌CGMCC 6624产生的蛋白类抑菌物质符合以上要求，所以确定为细菌素。

图5 抑菌蛋白对细菌CGMCC 6624活性的影响Fig.5 Effect on strain CGMCC 6624 to antimicrobial protein

2.7 细菌CGMCC 6624的鉴定

2.7.1 形态特征 细菌CGMCC 6624呈杆状，单个、成对或成链排列（图7a），0.6～0.85 μm×1.5～3.5 μm，有荚膜（图7b），无鞭毛，有芽孢，芽孢呈椭圆形（图7c）；菌落圆形，边缘整齐，凸起，光滑，透明，无色素产生（图8）。

2.7.2 生理生化鉴定 细菌CGMCC 6624的各项生理生化鉴定结果见表1。

2.7.3 16Sr DNA鉴定 以细菌CGMCC 6624的总DNA为模板，使用一对细菌通用引物扩增出长约1 542 bp的片段，登录GenBank序列号（Accession No） 为 JX025646。将该序列登陆http：//www．GenBank．com 进行BLAST比对，结果显示细菌CGMCC 6624与芽孢杆菌属具有较高的序列相似性，达到99%。从图9的发育树可以看出，细菌CGMCC 6624的遗传进化距离与Bacillus subtilis亲缘关系较近。综合细菌CGMCC 6624的培养特征、生理生化特性和系统发育分析结果，将其初步确定为枯草芽孢杆菌。

图7 细菌CGMCC 6624的个体形态特征Fig.7 Micrographic of strain CGMCC 6624

图8 细菌CGMCC 6624菌落形态Fig.8 Colony of strain CGMCC 6624

表1 细菌CGMCC 6624的生理生化特性Table1 The hysiological and biochemistry characteristics of CGMCC 6624

图9 依据16S rDNA基因序列构建的细菌CGMCC 6624系统发育树Fig.9 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain CGMCC 6624

2.8 细菌CGMCC 6624生物学特性研究

乙醇含量、初始pH值、培养温度对细菌CGMCC 6624生物量的影响见图10。乙醇对CGMCC 6624细菌生长具有一定的影响，当乙醇含量在8%以下，菌体能生长繁殖，10%以上菌体生长繁殖受到抑制（图10a）。调节发酵培养液的初始pH，结果表明pH值对菌种生物量的影响范围较宽，在pH 3至10之间菌体均可生长，pH 5.5时菌体生物量达到最大值（图10b）。培养温度对菌株CGMCC 6624生物量的影响较大，菌体在30℃菌体生长快，35℃以上生长繁殖逐渐变缓，60℃时菌株不生长繁殖（图10c）。

图10 乙醇含量、pH值、温度对菌株 CGMCC 6624生物量的影响Fig.10 Effect on the growth conditions of CGMCC 6624

3 结论

从醋醅中分离得到1株具有广谱抑菌活性的细菌CGMCC 6624，所产抑菌物质对大肠杆菌、葡萄球菌、芽孢杆菌都有较强的拮抗作用。

结合酸抑菌排除试验、过氧化氢抑菌排除试验、蛋白酶消化抑菌物质试验，抑菌蛋白生成与细菌CGMCC 6624生长曲线的关系及细菌CGMCC 6624对抑菌蛋白生长免疫特性的研究，确定细菌CGMCC 6624产生的抑菌物质除过氧化氢外主要为蛋白质类物质--细菌素。

乙醇含量、初始pH值、培养温度对细菌CGMCC 6624生长具有一定的影响，其在pH 5，温度30℃，乙醇含量为0的发酵培养液中生长良好；可以耐受pH 3～11，且碱性条件下生长优于酸性条件；最高耐受温度为50℃；最高耐受乙醇体积分数为8%。

以上研究将为该菌株在醋醅发酵过程中的应用及其微生物制剂和细菌素的开发奠定基础。