钒在不同品种玉米中的积累和化学形态特征

侯 明,杨心瀚,赵菲菲,霍 岩

(1.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西 桂林 541004;2.广西高校食品安全与检测重点实验室,广西 桂林 541004)

环境重金属污染直接影响农作物的产量和质量,并通过食物链增加人体致癌风险[1-2]。玉米是广泛种植的粮食作物,是人们生活中常见的食品。如果土壤受到重金属污染,会致使玉米作物吸收并过量累积,这不仅影响其生长发育,引起产量降低,而且会严重影响玉米品质,威胁人体健康。对玉米植株中重金属的生物化学作用进行研究,有利于阐明重金属在玉米植株内的富集、迁移转化和耐性机制。重金属经过植物的吸收和转运后,会与植物体中有机酸、蛋白质等结合,以不同化学形态存在于植物中。重金属化学形态不同,其迁移能力、活性有着显著差异,对植物的生长影响也不同[3],近年来重金属化学形态分布研究引起人们的关注。程海宽等[4]研究了Pb 胁迫下不同品种玉米根、茎叶中 Pb化学形态变化；王吉秀等[5]研究小花南芥与玉米间作对 Pb化学形态的影响。上述研究表明,Pb主要以无毒的醋酸提取态(FHAc)和盐酸提取态(FHCl)形式存在,占比高达60%～87%,玉米根部Pb富集能力较强,而不同品种玉米对Pb的耐性不同。间作增加了植物根际土壤溶液和根、茎叶中pH,使玉米 Pb 富集系数和转运系数显著降低,促使Pb的生物活性下降。司江英等[6]研究发现,就低浓度Cu处理而言,玉米植株根部Cu形态主要为FHCl,茎叶部Cu以氯化钠提取态(FNaCl)占优势；随着Cu浓度的升高,根部和茎叶部则以乙醇提取态(FE)为主,活性较强的FE容易向地上部转移,对植物造成危害。CI等[7]的研究表明,土壤中w(As)为12.5和25 mg·kg-1时可促进玉米生长和谷物的营养质量,而较高浓度As(50和100 mg·kg-1)对作物产生毒性作用。As5+是被玉米作物吸收的主要化学形式,显示出最高的植物毒性,玉米作物中高As浓度会导致氧化应激,并影响植物发育[8]。植物根部和茎叶中金属均以FHAc、FHCl和FNaCl形态为主,说明大多数重金属与未溶解的磷酸盐、草酸盐、果胶和蛋白质结合,这些物质沉积在植物根组织的细胞壁中,从而减少重金属向地上部迁移,减轻了其毒害作用[9-11]。不同植物种类或相同植物不同金属的化学形态不同。

钒(V)不是植物必需的微量元素,低浓度V有利于枸杞植株、大豆和甘蔗的生长,促进植物对磷的吸收,高浓度V对植物产生毒性作用,抑制大豆萌发、甘蔗的开花和髓的形成,影响作物产量和质量[12-13]。SACO等[14]研究了菜豆(Phaseolusvulgaris)根和叶片中V的分布,根和叶片中V含量随着营养液中V浓度增加而增加,但叶片中V含量远低于根中V含量,说明V从植物根部到地上部分的迁移率较低。IMTIAZ等[15]研究表明,随着V水平的增加,鹰嘴豆中蛋白质含量和耐受性指数显著下降,植物暴露在较高浓度V中,细胞活力受到严重损害,诱发了植物的细胞死亡。研究结果表明,V应列为有毒重金属[16-17]。我国贡献了世界V产量的57%。由于采矿和冶炼活动的增加,在中国西南地区有26.49%土壤被V污染[18],目前人们对土壤中V的研究较为深入,而植物中V的毒性和耐性机制研究较少。因此,为了探明V在不同品种甜玉米中的积累、运输和耐受机制,笔者在已有研究成果[19]的基础上,采用盆栽试验,研究了不同品种甜玉米幼苗中V的积累和化学形态,以阐明V在玉米作物中的富集转运特点和不同品种玉米对V的解毒作用,为V在环境污染中的风险评估和预防提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集桂林理工大学雁山校区附近农田土壤作为盆栽试验土壤,土壤基本性质:pH为6.09,w(有机质)为9.86 g·kg-1,阳离子交换量为7.14 cmol·kg-1,w(氮)为1.22 g·kg-1,w(磷)为0.83 g·kg-1,w(钾)为14.2 g·kg-1,w(全钒)为95.06 mg·kg-1。供试玉米(Zeamays)种子为美甜糯八号(大民种业股份有限公司)和益甜608(广西浩凯生物科技有限公司)。

1.2 试验设计与处理

盆栽试验在桂林理工大学塑料大棚中进行。土壤晾干,按每个塑料盆(18 cm×15 cm×13.5 cm)装入过筛(孔径为3.2 mm)后的土壤(以干土计)2 kg,每kg土壤施0.2 g N〔CO(NH2)2〕、0.2 g P2O5(KH2PO4)和0.1 g K2O(K2SO4)作为底肥,以粉末形式与土壤混匀。试验设置6种处理,分别以NH4VO3固体粉末形式加入[20]的V含量为0、50、100、200、300和500 mg·kg-1,每个处理设置10个重复,充分混匀后陈化1周,备用。挑选籽粒饱满的甜玉米(美甜糯八号,益甜608)种子,用φ=0.3%的H2O2浸泡30 min,洗净,用纯水浸泡6 h后,于30 ℃ 条件下烘箱中催芽,将已萌发小芽的玉米种子播种于盆栽土壤中,待幼苗长至3片叶时每盆保留长势一致的植株2株,按期浇水,以保持土壤湿度。在甜玉米生长36 d之后,分玉米植株根、茎叶采集,用清水洗净(根部用0.1 mo1·L-1EDTA溶液浸泡以除去表面离子),再用纯水洗净,于90 ℃条件下杀青30 min,转至60 ℃条件下烘干,用植物粉碎机粉碎后过0.154 mm孔径筛,装入样品袋,于干燥器中保存备用。

1.3 试验方法

1.3.1玉米植株体内V的形态分离

参照许嘉琳等[3]和吴慧梅等[20]的化学试剂提取法,对玉米植株体内不同形态V进行逐步提取。提取剂依次为φ=80%的乙醇(乙醇提取态，FE)、0.6 mol·L-1盐酸(盐酸提取态，FHCl),最后得到残留态(FR)。具体操作如下:准确称取0.50 g植物粉末于50 mL离心管中,加入10 mL提取剂,在25 ℃条件下恒温振荡20 h后,按10 000 r·min-1离心10 min,倒出上清液,再加入10 mL提取剂,于25 ℃条件下恒温振荡2 h,离心分离,重复2次,将3次离心液全部收集在150 mL锥形瓶中。

1.3.2样品中V含量的测定

将上述V形态分离提取液置于可控数显温度电热板上加热浓缩后,用H2O2-HNO3(体积比为1∶5)消解至澄清(玉米中V总量采用相同方法消解),以水定容后采用石墨炉原子吸收分光光度法(GFAAS,novAA 400P,Analytik Jena AG)测定V含量。试验结果为3次重复测定的平均值。V的测定采用国家标准植物样品〔生物成分分析标准物质 GBW10023(GSB-14紫菜)〕进行对照试验。

1.4 数据处理

转运系数(translocation factor,TF)为地上部 V 含量与地下部V含量的比值。富集系数(bioconcentration factor,BF)为植物中V含量与土壤中V含量的比值。采用 Microsoft Excel 2010软件对数据进行统计分析,采用 Duncan多重比较法对试验数据间的差异显著性(P<0.05)进行多重比较。结果以平均值±标准差形式表示。

2 结果与分析

2.1 V在玉米植株中的积累分布

由表1可知,在不同含量V胁迫下,不同品种玉米根含量远大于茎叶中V含量。美甜糯八号和益甜608玉米幼苗根部V含量分别约占总量的83.91%～89.09%和84.59%～92.33%,可见,V主要富集在玉米植株根部,而在茎叶部分布很少。随着V含量的增大,不同品种玉米根和茎叶吸收的V含量均升高,与对照相比差异显著(P<0.05)。当w(V)从50增加到500 mg·kg-1时,与对照相比,美甜糯八号根部和茎叶部V含量分别增加56.6%、821.9%以及135.1%、813.5%;益甜608幼苗根部和茎叶部V含量分别增加56.6%、991.0%以及115.6%、584.4%。可见,美甜糯八号根和茎叶中V含量增幅相当,而益甜608根部增幅大于茎叶部。在相同含量V胁迫下,2个品种玉米幼苗茎叶中V含量相近,但根部对V的富集能力不同。当w(V)分别为200、300和500 mg·kg-1时,美甜糯八号和益甜608根中w(V)分别为24.70和26.78,34.61和40.69,55.22和74.19 μg·g-1,显然,益甜608根部对V的积累能力明显高于美甜糯八号。玉米根部对V 较强的固持作用,可以降低茎叶中V含量,减少V从根部到茎叶的转运,降低V对植物的伤害。不同含量V胁迫下,玉米幼苗的富集系数(BF)和转运系数(TF)不同。随着V含量的增大,2个品种玉米幼苗V含量的BF值增大,TF值除对照外逐渐降低。当w(V)达500 mg·kg-1时,美甜糯八号和益甜608的BF值分别为0.104和0.135。在V处理含量范围内,美甜糯八号和益甜608的TF值分别在0.122～0.192和0.083～0.182之间(表1)。2个玉米品种中,益甜608的BF较大,但TF较低,而美甜糯八号正好相反。

表1 2个品种玉米根和茎叶中V含量Table 1 V concentration in shoots and roots of two sweet maize cultivars

数据为平均值±标准差,n=3;同一列英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。BF和TF分别为富集系数和转运系数。

2.2 V在玉米植株中的化学形态分布

由形态分析结果(表2、图1)可知,不同含量V胁迫下,不同品种玉米根中V化学形态分布顺序为:美甜糯八号,FHCl>FE>FR,FHCl占总量的39.89%～44.48%,FHCl和FR比例之和为67.45%～70.87%;益甜608,FR>FE>FHCl,FR占总量的38.56%～49.35%,FHCl和FR比例之和为69.46%～74.30%。不同品种玉米茎叶中V化学形态分布特征相似,均为FE>FHCl>FR,美甜糯八号和益甜608茎叶FE分别占总量的46.36%～61.74%和40.59%～50.01%。以上结果表明,V在玉米根部以活性较低的FR和FHCl为主,使得V从根部向茎叶运移能力较低,活性较高的FE在茎叶中分布较多,V在茎叶中易于移动。随着V含量增加,2个品种玉米根部V各形态含量均明显增大,与对照相比差异达显著水平(P<0.05)；玉米茎叶中,除美甜糯八号V的FE含量差异显著外,其他各形态V含量差异显著或差异未达显著水平。由图1可知,随着V含量增大(50～500 mg·kg-1),美甜糯八号根部V各形态含量占比变化不大,益甜608根部FHCl含量占比升高(24.34%～28.65%),FR含量占比下降(44.39%～38.80%),FE含量占比趋于平稳。与根部相比,2个品种玉米茎叶部V各形态含量占比变化有所不同,美甜糯八号茎叶部FE含量占比从47.64%上升到61.04%,FHCl和FR含量占比分别从29.04%、23.31%下降到20.13%、17.70%;而益甜608茎叶部FE含量占比从48.96%下降到40.59%,FR含量占比从19.87%上升到26.42%,FHCl含量占比变化不大(图1)。上述结果表明,随着V含量的增大,美甜糯八号茎叶中V活性增加,V容易在植物组织中迁移,对植物毒性增加。

表2 2种玉米幼苗根和茎叶中V的化学形态Table 2 The chemical forms of V in shoots and roots of two sweet maize cultivars

FE、FHCl和FR分别表示乙醇提取态、盐酸提取态和残留态。数据为平均值±标准差,n=3;就某个玉米品种而言,同一列英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

图1 2种玉米幼苗根和茎叶中不同化学形态V含量占比Fig.1 Percentages of V content of different chemical forms in shoots and roots of two sweet maize cultivars

由植物中V各形态含量加和结果(表2)和V总量(表1)可知,两者存在一定偏差(相对误差在-3.8%～7.7%之间),可能是由于形态分析采用连续提取分离法,多次分离提取每个形态的试液(或残渣)后再消解和测定,每个形态V含量结果均存在误差,最后导致植物中V各形态含量加和误差更大,使得植物中绝大多数V各形态含量之和大于单独测得的V总量。如何将形态分离产生的误差降至最小,一直以来都是许多学者关心的问题。如果采用“植物形态成分分析标准物质”进行标准试样对照试验,将会极大地提高结果的准确性。

3 讨论

3.1 玉米中V的积累和耐性机制

玉米植株在有氧环境中生长,V主要以氧基钒酸盐(VO3-)形式存在,土壤中V5+被认为是毒性最强的V形态[16],这与ABBAS等[8]和ROSAS-CASTOR等[21]报道的As5+对玉米植物具有最强毒性的结论相似。土壤中添加钒酸盐,由于土壤的吸附作用,会降低V5+对植物的毒性[15]。TENG等[22]发现苜蓿能够从土壤中除去V,V首先富集于苜蓿根部,而在地上部分略有积累。随着V含量的增加,苜蓿枝条生物质减少,但对V吸收量增加。QIAN等[23]考察了美国新泽西州6大优势物种对V的吸收转运,不同植株部位V含量分布由高到低依次为根、叶片和茎。CHONGKID等[24]和CI等[7]研究表明,在添加V的水培水稻和土培玉米植物组织中,V和As含量分别按籽粒<茎叶<根以及籽粒<茎<叶≪根的顺序增加。笔者研究中,土壤添加不同含量V,2个品种玉米幼苗根部对V的积累均远大于茎叶部,在总量中分配比例最高达92.33%,此与前人研究结果一致。显然,玉米植株根部是存储V的主要部位,玉米幼苗根部对V的富集,可以降低V在植物中的生物有效性。随着 V含量的增加,2个品种玉米幼苗对V的富集能力增强(BF值增大),但将V从根部转运到茎叶的能力减小(TF值减小),表明较为发达的玉米根系固持V的能力较强,可以有效抑制V向地上部运输,减轻土壤中过量V5+对玉米幼苗茎叶的伤害。YANG等[13]研究结果也证实,从植物幼苗生长到生殖生长,大豆根部积累更多的V,只有<20%的V被输送到地上部。

土壤溶液中V浓度较低,可以刺激微量元素如Cu、Zn、Fe和Mo在植物中的吸收,尤其增强Fe的转运,从而促进植物生长。当ρ(V)>40 mg·L-1时,植物根长和茎高下降50%,抑制狗尾巴草的生长[25]。笔者研究也发现,在低含量V (≤300 mg·kg-1)胁迫下2个品种玉米幼苗均生长良好,吸收积累的V量相差不大;当V含量较高(>300 mg·kg-1)时,玉米生长受到抑制,2个品种玉米根部吸收V量显著不同,美甜糯八号BF基本不变(0.104),而益甜608根部积累的V量更多,BF达0.135,TF降低为0.083,表明不同品种玉米对V的吸收富集能力不同,其迁移能力和耐性也存在明显差异,益甜608具有较好的耐性。同理,MUHAMMAD等[26]对2种芥末基因型的研究表明,根系积累的V量都高于芽,而紫芥末对V的耐受性较高;MALLICK等[27]研究了对砷酸盐具有耐受性和敏感性的玉米品种的差异解毒机制,结果表明玉米的 cv.Azad kamal 品种对As的耐受性更强。由于土壤中V5+和As5+分别以钒酸盐(VO3-)和砷酸盐(AsO43-)形式存在,它们的行为相似,可以推测玉米对V的耐性机制为土壤溶液中V5+一旦被植物吸收,在根系内被还原为V4+,就会通过谷胱甘肽(GSH)的络合作用,形成V4+-硫醇盐配合物被隔离在根细胞液泡内,从而降低V从根部向地上部的转运量;而通过木质部和细胞磷酸盐转运蛋白转运到地上部的V,可以形成V4+-谷胱甘肽配合物储存在茎叶液泡中[27],减弱了V的毒性作用。TIAN等[28]发现在大白菜叶片中V4+占主导地位(占V总量的60%～80%),表明大白菜中存在V的生物还原作用。笔者的以往研究[18]发现,在一定V浓度范围内,V会诱导玉米幼苗体内GSH和植物螯合肽(PCs)的合成,GSH和PCs能与V螯合生成稳定硫肽复合物,降低重金属对植物的损伤,而与茎叶部相比玉米根部能合成更多的GSH和PCs,对V毒害作用的抵御能力大于茎叶,使玉米的耐性增强。能将吸收的重金属隔离在植物根部,阻止其向地上部分运输,不表现出明显中毒症状的植物被称为耐受非超富集型植物[29]；所以,玉米植物属耐性植物,而益甜608对V的耐性更好。玉米对V的解毒机制还需深入研究。

3.2 玉米中V的化学形态和耐性机制

金属不同的化学形态有不同的生物活性,是影响金属迁移、积累和毒性程度的重要因素。金属以难移动形态存在,被认为是植物解毒的重要方式;醇溶性无机盐、氨基酸盐以及水溶性有机酸盐等迁移能力较强,活性较大,对植物的毒害更大;盐酸提取态主要表现为重金属与有机酸、果胶酸和蛋白质等植物成分螯合,迁移能力较低;残渣态难于迁移,活性和毒性更低[3]。JIANG等[30]研究表明,玉米叶中Cd以难溶性磷酸盐形态沉积在液泡或细胞壁中,而玉米根和叶中Pb主要以活性较低的醋酸提取态、盐酸提取态和氯化钠提取态形式存在,减少了对植物的伤害。笔者研究中,2个品种玉米根部以活性较低的FHCl和FR为主,两者比例之和高达67.45%～74.30%,说明玉米吸收的大量V在植物体内结合成低活性草酸盐、果胶酸盐和蛋白质络合物,使得游离态V含量及迁移能力降低,避免了过量V 进入玉米茎叶组织,可大大降低游离V毒性[31]。这些研究结果同时证明,V在玉米根中的大量积累可能与植物体内V的化学形态和分布特征有很大关系。笔者所在课题组采用五步提取法研究了不同水稻品种V的化学形态[32],水稻根部V以活性较低的FHCl和FHAc为主,水稻植株吸收的V通过沉淀和络合等作用被固定在根部,限制了其转移到茎和叶。可见,笔者研究采用的两步形态分析方法所得结果与五步提取法所得结果一致,说明方法可靠。在不同品种玉米茎叶中,FE分布较多,V主要与醇溶性蛋白质、无机盐和氨基酸结合,过量V容易在植物茎叶部迁移积累,对玉米幼苗的生长发育造成毒害。美甜糯八号茎叶中FE在总量中分配比例比益甜608更大,表明V对不同品种玉米毒性以及植物对V的耐性有明显差异,这与程海宽等[4]研究结果相似。TIAN[28]在研究大白菜(Brassicarapa)中V积累和形态与土壤V的关系中发现,在V胁迫下,大白菜叶中V主要是流动性较大的水和乙醇的萃取物,可能对大白菜产生更大的毒性作用,这一结果也说明植物地上部储存活性较大的金属形态,使植物更易受到金属毒害。随着V含量的增大,2个品种玉米根部仍以FHCl和FR占优势,但茎叶中形态分配比例变化显著不同。美甜糯八号茎叶中FE比例有所增加,益甜608则由活性较高的FE向FR转化,后者可以更有效地抑制V在茎叶部的转运,减轻V对植物光合组织的损伤和毒害,增强植物耐性。

4 结论

(1)2个品种玉米幼苗地下部和地上部对V的积累能力均表现为根部远大于茎叶,玉米吸收的V主要富集在根部,占总量的84%以上。益甜608对V的富集能力较强,美甜糯八号对V有较好的迁移转运能力。

(2)2个品种玉米幼苗根中V以难溶性草酸盐、蛋白质结合态和残渣态为主,茎叶中V主要与醇溶性蛋白质、无机盐和氨基酸结合,表明大量V均以活性较低的形态沉积在根系,避免过量V迁移到地上部,能有效降低V对玉米幼苗的伤害。

(3)益甜608幼苗含有较多活性相对低的盐酸提取态和残渣态V,其根部对V的固持能力更强,植物耐性也更强。