HPLC法快速测定保健食品中化学药物添加的研究

金鑫，朱志英

（乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布012000）

随着肥胖症发病率逐年升高，现已成为危害人类健康的严重问题，减肥已成为现代人的潮流，而通过减肥保健品进行减肥是大多数肥胖或亚肥胖人群减肥方法的首选，减肥保健品的需求逐年增大。部分生产商为了突显保健品的减肥效果，非法添加盐酸芬氟拉明、西布曲明、氟苯丙胺等化学药物[1-3]，这些化学药物可通过影响神经递质活性抑制食欲、提高基础代谢率或阻断食物吸收等途径达到减肥目的，但也可引起焦虑、兴奋、便秘、失眠、心悸、食欲不振、心血管疾病，且对人体神经系统和心脏瓣膜易造成损伤，已被许多国家禁止生产和使用[4-6]。为保障消费者健康，促进减肥保健品产业健康发展，建立简便、准确的测定减肥保健品中非法添加化学药物的方法非常必要。

目前对于减肥保健品中非法添加化学药物的检测方法包括电化学分析法[7]、光谱法[8]、薄层色谱法[9]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-12]、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[13-17]等，其中电化学分析法、光谱法和薄层色谱法可同时检测药物种类不多；HPLC 法具有高效、简便、适用于大批量样品中多种药物的快速检测；LC-MS/MS 法具有灵敏度高、专属性强和准确度高等特点，但由于质谱仪价格相对昂贵、操作复杂、分析成本高，难以实现大批量样品的快速检测。本文选择减肥保健食品中12种可能非法添加化学药物（苯丙醇胺、麻黄碱、伪麻黄碱、咖啡因、芬氟拉明、普伐他汀、呋塞米、N，N-双去甲基西布曲明、氟西汀、酚酞、N-单去甲基西布曲明、西布曲明）为研究对象，采用酸化甲醇超声萃取、固相萃取柱Oasis MCX 净化，经二极管阵列检测器测定，建立HPLC 法测定减肥保健食品中12 种非法添加化学药物的含量，并采用LC-MS/MS 法对阳性样品进行确证，避免检测假阳性，以期为减肥保健食品中非法添加化学药物大批量快速检测提供简便、准确的分析技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10 种减肥保健食品（胶囊、口服液、片剂、冲剂等形态），均购自苏宁易购网上商城。

甲醇、乙腈、甲酸、丙酮，均为色谱纯：美国Tedia公司；盐酸、冰乙酸、氨水，均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水；12 种化学药物标准物质：苯丙醇胺、麻黄碱、伪麻黄碱、咖啡因、芬氟拉明、普伐他汀、呋塞米、N，N-双去甲基西布曲明、氟西汀、酚酞、N-单去甲基西布曲明、西布曲明：纯度均≥95.0%，中国药品生物制品检定所。12 种化学药物相关信息见表1。

1.2 仪器与设备

Waters 2695 型高效液相色谱仪、Waters Xevo TQD型串联四极杆质谱仪：美国Waters 公司；TP-114 型电子天平：美国Sartorious 公司；JP-060 型超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；Vortex-Genie2 型涡旋混合仪：美国 Scientific Industries 公司；Milli-Q 型超纯水器：美国Millipore 公司；Autotrace SPE 型全自动固相萃取仪：美国Caliper 公司；TTL-DC 型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流速为 0.2 mL/min；流动相A：甲醇；流动相 B：20 mmol/L 乙酸铵溶液（含0.1%冰乙酸）；检测波长：210、225、265 nm；流动相梯度洗脱条件：梯度洗脱程序：0～5.0 min，30%～60%A；5.0 min～14.0 min，60%～90%A；14.0 min～16.0 min，90%～30%A；16.0 min～18.0 min，30%A。

表1 12 种化学药物相关信息Table 1 Information of 12 kinds of chemistry medicine

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），ESI+模式和ESI-模式；扫描方式：多反应监测（multiplereactionmonitoring，MRM）；离子源温度：450 ℃。ESI+模式时：毛细管电压为4.0 kV，脱溶剂气温度为300 ℃，去溶剂气流量为600 L/h，锥孔气流速为55 L/h；ESI-模式时：毛细管电压为3.5 kV，脱溶剂气温度为350 ℃，去溶剂气流量为700 L/h，锥孔气流速为50 L/h。12 种化学药物的其他质谱参数见表2。

1.3.3 样品前处理

取样品2.0 g（精度至0.1 mg）置于50 mL 离心管中，加入15 mL 甲醇（含0.1%甲酸），涡旋混合后超声（900 W，40 kHz）提取 20 min，以 10 000 r/min 离心5 min，上清液旋转蒸发浓缩至3 mL，经Oasis MCX 固相萃取柱（使用前依次用丙酮、甲醇、水各3 mL 活化）净化，依次用0.1 mol/L 盐酸3 mL、30%甲醇（含2%氨水）3 mL 淋洗，再用6 mL 甲醇-水-氨水（体积比为80 ∶12 ∶8）洗脱，洗脱液氮气吹干，用 1 mL 流动相溶解残渣后过0.22 μm 滤膜后备用。

表2 12 种化学药物质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs

1.3.4 标准曲线的建立

取12 种化学药物标准物质适量，用甲醇溶解，制成浓度为1 000 μg/mL 标准储备液；用甲醇逐级稀释500 μg/mL 标准储备液，依次配置质量浓度为50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/mL 的混合标准工作溶液进行测定，以混合标准工作溶液的质量浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 数据处理

每组试验重复6 次，结果表示为平均值，数据分析采用SPSS 16.0 软件分析；采用Origin 7.5 软件作图。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

通过紫外检测器在波长190 nm～800 nm 范围内对12 种减肥保健食品中可能非法添加化学药物进行紫外光谱吸收峰扫描，经优化后结果显示：苯丙醇胺、麻黄碱、伪麻黄碱的检测波长选择210 nm，咖啡因、N，N-双去甲基西布曲明、氟西汀、酚酞、N-单去甲基西布曲明、西布曲明的检测波长选择225 nm；芬氟拉明、普伐他汀、呋塞米的检测波长选择265 nm。

2.2 色谱柱的选择

选择合适的色谱柱是液相色谱分析的关键，考察了 Waters XTerra C18、Diamonsil C18、Waters Atlantis T3 C18、Penomenex C18、Inertsil C18、Waters CORTECS C18、Symmetry C18等不同C18柱对12 种减肥保健食品中可能非法添加化学药物的分离效果。高效液相色谱图见图1。

图1 12 种可能非法添加化学药物标准品高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs

由图1 可知：Waters Atlantis T3 C18色谱柱对 12 种减肥保健食品中可能非法添加化学药物具有良好的保留、分离能力（图1），这可能是由于目标物与Atlantis T3 C18色谱柱固定相上的硅羟基之间的相互作用所致。因此分析用色谱柱选择Waters XTerra C18。

2.3 流动相的选择

以Waters Atlantis T3 C18为分析柱，以甲醇/乙腈为有机相、以不同浓度的乙酸铵溶液/磷酸溶液为水相，分别考察不同流动相体系对减肥保健食品中12 种可能非法添加化学药物的色谱分离行为的影响。试验结果显示：当采用甲醇/乙腈-水/磷酸溶液为流动相时，部分目标物色谱峰分离度和峰形较差；当采用甲醇-20 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相时，经逐步优化流动相梯度洗脱程序，12 种化学药物可实现分离，尤其是乙酸铵溶液中加入0.1%冰乙酸，色谱峰峰型更为符合正态分布，保留时间适中，基线平稳且分离效果良好，因此流动相选择甲醇-20 mmol/L 乙酸铵溶液（含0.1%冰乙酸）。

2.4 提取溶剂的选择

由于12 种化学药物大部分溶解于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷和酸性水溶液中，故考察甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷和酸性水溶液对减肥保健食品中12 种可能非法添加化学药物的提取效果。试验结果显示：采用甲醇作为提取溶剂时，大部分化学药物的提取回收率较高（＞90%），但为提高弱极性的西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明提取效率，在甲醇中加入0.1%甲酸，可提高12 种化学药物的提取回收率（平均值为96.4%），且有利于各目标物充分解离成带电荷基团，以便后续与固相萃取柱键合硅胶上的带电基团互相吸附。因此提取溶剂选择甲醇（含0.1%甲酸）。

2.5 净化柱的选择

考察了弱阳离子（weak cation exchanger，WCX）、弱阴离子（weak anion exchanger，WAX）、混合型阳离子（mixed-mode cation exchanger，MCX）、混合型阴离子（mixed-mode anion exchanger，MAX）、亲水-亲酯（hydrophilic-lipophilic balance，HLB）、硅胶（silica，SIL）等不同极性固相萃取柱对12 种减肥保健食品中可能非法添加化学药物的净化回收效果。固相萃取柱对12 种可能非法添加化学药物的平均净化回收率见图2。

图2 固相萃取柱对12 种可能非法添加化学药物的平均净化回收率Fig.2 Average extraction rate of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs by solid phase extraction column

由图2 可知：根据不同固相萃取柱对12 种化学药物平均净化回收率大小排序：MCX（97.2 %）＞WCX（91.6%）＞MAX（87.4%）＞WAX（84.1%）＞HLB（83.6%）＞ SIL（80.3%），其中 MCX 对 12 种化学药物的平均净化回收率在94.3%～102.7%，净化回收效果最好，这可能是由于MCX 属于混合型阳离子固相萃取柱，具有强阳离子交换和反向保留作用的混合型吸附剂，经0.1 mol/L 盐酸淋洗可有效洗脱样品中中性或酸性杂质，经30%甲醇（含2%氨水）可洗脱样品中部分碱性干扰杂质。因此净化柱选择MCX 柱。

2.6 质谱确证条件的优化

由于减肥保健食品基质较为复杂，采用HPLC 法测定减肥保健食品中12 种可能非法添加化学药物时容易造成假阳性和假阴性；为验证HPLC 法检测结果的准确性，本文采用LC-MS/MS 法对筛选出的非法添加化学药物的阳性样品进行质谱确证。12 种可能非法添加化学药物的MRM 总离子流图见图3。

图3 12 种可能非法添加化学药物的MRM 总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of 12 kinds of illegally adulterated chemical drugs

由图3 可知：普伐他汀、呋塞米在离子源ESI-电离方式下形成的[M-H]-准分子离子响应信号较强，其余10 种化学药物在ESI+电离方式下形成的[M+H]+准分子离子响应信号较强；采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，经优化碰撞能量和锥孔电压，使各目标物离子化效率达到最佳，均获得响应信号稳定的碎片离子。

2.7 线性范围和检出限

用甲醇依次配制质量浓度为 50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/mL 的混合标准工作溶液，按本文所建HPLC 法对12 种可能非法添加化学药物进行测定，绘制标准曲线；以空白样品基质稀释标准溶液至信噪比S/N=10 为方法定量限（limit of quantity，LOQ），以信噪比 S/N=3 为方法检出限（limite of detection，LOD），线性方程、相关系数、检出限和定量限等参数见表3。

由表3 可知：12 种可能非法添加化学药物在1.0 μg/mL～50.0 μg/mL 范围内，12 种可能非法添加化学药物质量浓度（x）与其色谱峰面积（y）呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999 5；LOQ 在0.25 mg/kg～1.0 mg/kg，LOD 在 0.08 mg/kg～0.30 mg/kg。

表3 线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficients，detection limit and limit of quantitation

2.8 回收率和精密度

根据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F 中检测方法确认的技术要求，在3份不含目标物的减肥保健食品中添加12 种化学药物混合标准工作溶液，质量浓度分别为1.0 mg/kg（方法测定低限）、2.0 mg/kg（两倍方法测定低限）、10.0 mg/kg（十倍方法测定低限），每个浓度做6 次平行，按本文所建HPLC 法测定回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表4。

表4 回收率和相对标准偏差（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation（n=6）

由表4 可知：在 1.0 mg/kg～10.0 mg/kg 加标浓度范围内，12 种可能非法添加化学药物的回收率在88.6%～102.6%，RSD 在 1.2%～3.6%，其结果符合 GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的相关要求。

2.9 实际样品的测定

针对随机选购的10 份减肥保健食品，其中胶囊2份、口服液2 份、片剂3 份、冲剂3 份，按本文所建HPLC 法快速筛查减肥保健食品中12 种可能非法添加化学药物的含量；采用LC-MS/MS 法对阳性样品进行质谱确证，避免假阳性。结果显示：10 份受检的样品，1 份样品检出含有N，N-双去甲基西布曲明，检出量为37.2 mg/kg。这表明部分减肥保健食品生产商为了增强产品减肥效果和逃避监管部门的行政监督，非法添加与西布曲明具有同样减肥活性的N，N-双去甲基西布曲明。为保护消费者合法权益和身体健康，应加强对减肥保健食品中可能非法添加化学药物风险监测。

3 结论

本文以12 种减肥保健食品中可能非法添加的化学药物为研究对象，采用酸化甲醇超声萃取、固相萃取柱Oasis MCX 净化，经二极管阵列检测器测定，建立了HPLC 法测定减肥保健食品中12 种非法添加化学药物的含量，并采用LC-MS/MS 法对阳性样品进行确证。研究结果显示：在 1.0 μg/mL～50.0 μg/mL 范围内，12 种可能非法添加化学药物质量浓度与其色谱峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999 5；LOQ 在 0.25 mg/kg ～1.0 mg/kg，LOD 在 0.08 mg/kg ～0.30 mg/kg；回收率在88.6%～102.6%，RSD 在1.2%～3.6%。本文所建HPLC 法简便高效、回收率高、精密度好，可为减肥保健食品中非法添加化学药物大批量快速检测提供简便准确的分析技术。