Bt 新菌株资源的采集与鉴定

黄勤清， 黄晓梅

福建农业职业技术学院，福建 福州350119

在微生物农药中，苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前应用广泛的微生物杀虫剂之一，可以产生杀虫蛋白晶体(insecticidal crystal proteins， ICPs)(黄勤清，2008； Huang et al.，2018)。Bt 对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种昆虫有毒杀活性，害虫不易产生抗性，成本低，便于工业化生产，不污染环境(张巧铃等，2015)。

Bt 分布广泛，可分离自昆虫、土壤、植物和水环境等(徐卓吟等，2016)。 近年来，对许多国家大量生境进行调查发现，虽然Bt 最初发现于染病地中海粉螟Ephestia kuehniella Zeller，但Bt 的存在和昆虫没有必然联系，这种细菌依然大量存在于一些没有昆虫的环境中(张灵玲等，2008)。 Bt 对蚊虫也有较好的防治效果(Ben-Dov，2014)。 研究学者已经分离出了大量的Bt 菌株，但新菌株的筛选仍在继续。 这是因为虽然害虫对Bt 高度敏感，但现有Bt 菌株仍然无法防治其他大量害虫。 因此，继续分离新的高效特效Bt 菌株十分必要(黄勤清等，2006； 魏华等，2018；Sun ＆ Yu，2000)。 武夷山是国家保护区，有宝贵的微生物菌种资源。 因此，本研究从武夷山等福建省多个地区采集土壤样品，从中分离纯化得到71 株Bt 新菌株，并研究其对致倦库蚊Culex quinquefasciatus Say 的杀虫效果，以期进一步丰富Bt 菌种资源，为高效杀蚊微生物制剂的研发奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分离培养基 培养基BPA：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，乙酸钠34 g，加ddH2O 至1000 mL，pH 值7.2～7.4。 培养基BP：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，琼脂18 g，NaCl 5 g，加水至1000 mL，pH 值7.0 ～7.2。1/2 LB 培养基：蛋白胨5 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，加水至1000 mL，pH 值7.0～7.2。

1.1.2 实验药剂 2 g·mol-1NaAc；100 mg·mL-1青霉素钠盐；复红染色剂(100 mL)： 碱性品红(0.1 g)+95%酒精(10 mL)+3%苯酚水溶液(90 mL)。

1.1.3 土壤样品 从福建省武夷山自然保护区、建阳、建瓯、浦城等地区采集土壤样品分离与纯化Bt。

1.1.4 供试昆虫 以4 龄致倦库蚊进行生物测定，试虫由福建农林大学生物农药研究中心提供。

1.1.5 实验主要仪器 DYC-28C 型电泳槽、HHW21-600 型电热恒温水浴锅、HQ-45A 恒温摇床和BACKMAN 离心机。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品采集 采集地表5 cm 以下的土壤进行菌株分离，将土样放入干净的自封袋，带回实验室开展菌株分离等工作。

1.2.2 Bt 菌株分离和镜检 称取0.1 g 土壤放入BPA 培养基中，并加入100 mg·mL-1青霉素钠盐80 μL，2 g·mol-1NaAc 325 μL，置于摇床上(温度33.2 ℃；转数130 r·min-1)培养42 h 后取下，取200 μL 菌液装入离心管于75～80 ℃水浴中热处理10～15 min， 稍微静置后冰浴5 min，吸0.2 mL 于BP 平板上，均匀涂布，倒置于30 ℃培养箱中培养24 h。 挑选5 个类似于Bt 的菌落(干燥、不透明、乳白色、均一或边缘有缺刻)接种到BP 斜面上，30 ℃培养72 h。 用复红染色剂染色进行镜检。

1.2.3 Bt 菌株杀蚊生物测定 用0.85%的NaCl 将培养2 d 的Bt 菌株稀释至D600nm为0.1。 取1 mL 加入50 mL 蒸馏水中，放入45 只致倦库蚊4 龄幼虫，放置于25 ℃恒温箱48 h 后，记录致倦库蚊Ⅳ龄幼虫的死亡数。 重复3 次，用无菌水做对照。

1.2.4 高效杀蚊Bt 菌株部分杀虫基因检测 以高效杀蚊菌株的总DNA 为模板，利用通用引物分别PCR 扩增部分cry 基因和几丁质酶基因等杀虫基因。 其中，cry5、cry6、cry8 和cry11 基因的引物cry5F/cry5R、cry6F/cry6R、cry8F/cry8R 和cry11F/cry11R 参考黄天培(2006)的实验设计；cry1、cry7、cry9 基因的引物K5un2/K3un2 和K5un3/K3un3，cry1I 基因的引物S5uni/S3uni，cry2 基因的引物S5un2/S3un2，cry4、cry10 基因的引物S5un4/S3un4参考前人文献(宋福平等，1998；Kuo ＆ Chak，1996；Song et al.，2003)；几丁质酶基因的引物参考Bt WB7 的序列(GenBank 登录号AY074882)设计Chi-F(5′-GGAATTCATGGCTATGAGGTCTC-3′)和Chi-R(5′-CCCAAGCTT CTAGTTTTCGCTAATG-3′) ( 骆兰，2008)。

1.2.5 高效杀蚊Bt 菌株杀虫晶体蛋白检测 参考张灵玲等(2008)的方法分离杀虫晶体蛋白，利用SDS-PAGE 进行检测。

2 结果与分析

2.1 Bt 新菌株资源的采集与鉴定

从武夷山自然保护区等福建省内各地采集的125 份土壤样品中分离Bt。 Bt 芽胞为椭圆形，杀虫晶体蛋白以菱形为主(图1)。 具有上述特征的菌株初步鉴定为Bt。 共纯化得到71 株Bt 新菌株。由此可见，Bt 普遍存在于土壤中，福建省具有丰富的Bt 菌种资源。

图1 Bt QQ66(A)和QQ92 形态(B)Fig.1 Morphology of Bt QQ66 (A)and QQ92(B)

2.2 Bt 菌株杀蚊生物测定

生物测定结果表明，共有4 个Bt 新菌株对致倦库蚊有效，死亡率均达50%以上，其中菌株QQ66和QQ92 杀虫效果最好，校正死亡率均达到100%，而QQ13 和QQ42 的杀虫效果相对较差，分别是64.4%和57.8%(表1)。

2.3 高效杀蚊Bt 菌株QQ66 和QQ92 部分杀虫基因检测

杀虫基因PCR 产物电泳检测结果表明，QQ66和QQ92 菌株均有约2 ku 大小的几丁质酶基因(图2)，没有检测到cry1、cry1I、cry2、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、 cry10 和cry11 基因。

表1 对致倦库蚊4 龄幼虫有效Bt 菌株的生物测定Table 1 Bioassay of Bt isolates effective against 4th instar larvae of C. quinquefasciatus(n=45 in all tests)

图2 Bt 菌株QQ66 和QQ92 几丁质酶基因PCR 产物电泳Fig.2 Electrophoresis of PCR products of chitinase genes from Bt QQ66 and QQ92

2.4 高效杀蚊Bt 菌株QQ66 和QQ92 杀虫晶体蛋白检测

对QQ66 和QQ92 菌株进行SDS-PAGE 检测，发现QQ66 和QQ92 菌株在75～100 ku 处各有一条杀虫晶体蛋白条带(图3)。

3 讨论

近年来，随着可持续发展观的深入人心，保护环境、提高环境质量成为全人类的共识。 在生物农药中，研究最深入、使用最广泛的首推Bt(姚荣英，2009； Dai et al.，2016)。

要开发出高效的微生物杀蚊剂，关键是要有自己的优良生产菌种。 寻找高效菌株对我国生物杀虫剂的生产有着十分重要的意义(Huang et al.，2018)，研究人员也不断地在寻找从不同材料上分离Bt 的新方法。 本研究以武夷山自然保护区为主要采集区，采集到的125 份土壤样品中分离出Bt 71 株。 结果表明，Bt 普遍存在于土壤中。

图3 Bt 菌株QQ66 和QQ92 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of ICPs from Bt QQ66 and QQ92

由于双翅目的蚊虫传播着各种疾病，使得全世界半数以上的人口受到其传播的疾病的威胁。 每年数亿人受蚊媒疾病的折磨，其中有几百万人被夺去生命，因此，它是人类生存和健康的大敌(Zhang et al.，2017)。 本研究以致倦库蚊4 龄幼虫作为双翅目靶标害虫进行生物毒力测定，得到4 株毒性较高的菌株，其中QQ66 和QQ92 菌株均具有较高的杀虫活性。

QQ66 和QQ92 菌株均有几丁质酶基因，没有检测到cry1、cry1I、cry2、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10 和cry11 基因，在75～100 ku 处各有一条杀虫晶体蛋白条带。 这说明QQ66 和QQ92 菌株可能含有较新的杀蚊cry 基因(黄天培，2006； 宋福平等，1998；Kuo ＆ Chak，1996； Song et al.，2003)。

今后，将对得到的2 株具有高杀虫毒力的Bt菌株进一步研究，如有效基因的克隆、鉴定及表达等，以筛选和构建出具有生态、经济和社会效益的高效工程菌。