乳蛋白抗氧化肽的研究进展

彭 巧，马洪鑫，程 浩，张福梅，王亚杰，高丹丹

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124；2.西北民族大学实验教学部，甘肃兰州 730030）

人体细胞利用氧气产生能量，而自由基是新陈代谢的结果。人体有相对稳定的抗氧化防御体系，但随着年龄的增长或机体处于不良的外界环境时，体内的自由基产生过多或清除过慢会造成细胞生物膜被破坏、肽链特殊基团或肽键产生干扰及脱氧核糖核酸分子结构改变，进而引起多不饱和脂肪酸氧化，导致慢性和退行性疾病[1]。此外，食品氧化会使食品腐败变质，甚至会产生致突变的物质。抗氧化剂是一种能够延缓或抑制食物或人体氧化过程，预防氧化应激相关疾病的物质，具有阻止自由基的形成或清除自由基、过氧化氢和其他过氧化物，从而发挥抗氧化作用[2]。目前常见的化学合成抗氧化剂主要是酚类化合物，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、叔丁基氢醌（TBHQ）、没食子酸丙酯（PG）等。这些抗氧化剂能通过释放氢离子形成自由基，终止自由基传递链反应，从而阻断油脂自动氧化，应用于食品中可以防止植物油的氧化酸败、延长油脂的贮藏期，应用于化妆品中，可抑制皮脂的产生，降低皮肤表面色素的沉着度，有延缓衰老、抗皱去纹的功效。但是，这些化学抗氧化剂存在一定的毒理作用，Goodman D L等人[3]发现BHT与BHA似乎能够加重某些慢性荨麻疹患者的症状。有研究表明，服用大剂量TBHQ可引起恶心、虚脱、耳鸣、呕吐和急性脑综合征；可使儿童患多动症、哮喘及皮炎、鼻炎炎症，还可影响女性雌激素水平。我国对这些抗氧化剂的使用范围和剂量也做出了严格的规定。因此、安全性高、副作用小的天然抗氧化剂更加受到人们的青睐，如黄酮、单宁、维生素类、茶多酚等。

近年来，乳源蛋白抗氧化肽的研究备受国内外学者的关注，许多学者从各类乳蛋白中发现了具有抗氧化活性的肽段。1979年，Brantl V等人[4]首次从牛乳酪蛋白中发现了具有类吗啡活性的肽类物质，乳源生物活性肽的研究迅速发展。乳蛋白经消化后可以产生具有抗氧化活性的物质，这些物质是由1～20个氨基酸以不同组成和排列形式构成的肽类物质，其分子质量通常在5 ku以下。乳蛋白抗氧化肽能通过多种途径抑制脂质氧化，包括活性氧的失活、自由基的清除、螯合金属离子、减少氢过氧化物和改变食品体系的物理性质等，调整及改善机体生理功能，从而促进人体健康。主要介绍乳蛋白的分类、制备和分离纯化乳源抗氧化肽的方法，分析抗氧化肽的研究现状，为今后乳蛋白抗氧化肽及其相关产品的进一步研究奠定基础。

1 乳蛋白分类

乳蛋白营养价值高，包含人体所需全部氨基酸，结构比例合理，能促进人体的生长发育和各项生理代谢活动；其生物价达到85，易被人体吸收，是有益于人体健康的优质蛋白质。乳蛋白按照在乳中呈现状态可分为乳清蛋白、酪蛋白、部分的乳脂肪球膜蛋白和其他蛋白。

1.1 酪蛋白

酪蛋白又称乳酪、干酪素，是动物乳中特有的一种含磷钙的结合蛋白质。在牛乳、人乳、驴乳和羊乳中，其含量分别为总蛋白质的80%，29%，35%，75%[5]。酪蛋白分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三大类，其分子量大都在20～25 ku。其中含量最多的是αs-酪蛋白，在脱脂牛乳中αs-酪蛋白占总酪蛋白含量的38%。在总αs-酪蛋白中，80%为αs1-酪蛋白，分子量为23.5 ku；20%为αs2-酪蛋白，分子量为25.2 ku。β-酪蛋白含量比αs-酪蛋白略低，在牛乳脱脂乳中总酪蛋白含量为35%，分子量为24 ku。κ-酪蛋白含量在脱脂牛乳酪蛋白中约为13%，分子质量为19 ku；κ-酪蛋白对钙不敏感而对凝乳酶敏感，是乳中唯一含有糖成分的酪蛋白[6]。

1.2 乳清蛋白

乳清蛋白是脱脂乳去除酪蛋白沉淀之后上清液中多种蛋白质组分的统称，在牛乳总蛋白质含量的20%，在人乳中约为总蛋白质的71%，在驴乳中约为总蛋白质的64%，在羊乳中为总蛋白质的23%～25%[12]。乳清蛋白可分为α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、生物活性因子等。含量最多的是β-乳球蛋白，分子量为17 ku，为乳清蛋白总量的50%～55%；其次是α-乳白蛋白，分子量为12 ku，其含量与乳清蛋白总量的20%～25%；免疫球蛋白分为重链蛋白与轻链蛋白，重链的含量为10%～15%，牛血清白蛋白分子量为67 ku，其含量为乳清蛋白总含量的5%～10%，其他种类蛋白如乳铁蛋白等共占乳清蛋白总含量的11.5%～17.0%[7-8]。

1.3 乳脂肪球膜蛋白

乳脂肪球膜蛋白以一种微小的球状物存在于乳中，球状直径为0.2～15.0μm，被一层乳脂肪球膜包裹着。乳脂肪膜球蛋白是一种膜结合蛋白，含有25%～60%的蛋白质，占乳中蛋白质的1%～2%[9]。

1.4 其他蛋白

除以上几种特殊蛋白质外，乳蛋白还含少量的其他蛋白质和酶蛋白，如酒精可溶性蛋白及血纤蛋白相类似的蛋白。

2 乳源抗氧化肽的制备

乳蛋白抗氧化肽常用的制备方法有酶法与微生物发酵法2种。酶法制备中常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶等，酶法反应条件温和、无异味、安全、催化位置有方向性，但反应副产物多、产率低。微生物发酵法是利用瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌及鼠李糖乳杆菌GG株等微生物，在有氧或无氧条件下的生命活动来生产不同氨基酸序列和分子量的肽，这些肽类是微生物菌体本身，或者直接代谢产物或次级代谢产物，微生物种类多、繁殖快、培养简单，利用其法制备成本低、产率高，但存在菌种不稳定、易产生变异、产物不稳定等缺点。近年来，国内外学者采用微生物法和酶法水解不同乳蛋白制备了大量乳源抗氧化肽，并对其序列进行分离纯化。

乳源性抗氧化肽的制备方法及其序列见表1。

3 乳蛋白抗氧化肽的分离纯化及鉴定

乳蛋白抗氧化肽的氨基酸序列，直接影响其抗氧化活性。对其进行分离纯化和鉴定，对进一步研究其构效关系有很大的意义。目前常用的方法主要有超滤、离子交换、凝胶层析、亲和层析、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等。

3.1 超滤

超滤是一种依据膜截留分子量来分离物质的技术，即在一定压力（一般为0.1～0.5 MPa）下，样品被压入系统，不同分子量的物质经过膜时，超过膜体积的大分子物质被膜体积截留并作为浓缩物再循环，溶剂和小分子物质将通过膜并作为渗透剂被收集，从而达到分离纯化的目的。在分离纯化乳蛋白抗氧化肽时，通常把超滤作为初步分离的手段。Chang O K等人[28]将牛酪蛋白水解产物超滤24 h，分离出＞10 ku，3～10 ku，＜3 ku 3个组分，发现＜3 ku组分显示出最高的抗氧化活性。Puchalska P等人[33]采用3，5，10 ku的分子量截流过滤器对一定浓度的婴儿配方奶粉进行超滤，得到分子量为5～10 ku，3～5 ku和小于3 ku的3个级分，然后进一步分离纯化，鉴定出内源抗氧化肽和ACE抑制肽的序列结构。Kumar D等人[34]采用超滤技术对骆驼乳蛋白水解产物进行分馏，在组分F2（1～5 ku）和F3（5～10 ku）均表现出较高的抗氧化活性，表明骆驼乳蛋白是生产蛋白质水解物的有价值的来源。

表1 乳源性抗氧化肽的制备方法及其序列

3.2 凝胶层析

凝胶层析可用于分离不同大小的分子。凝胶过滤柱的柱材由交联聚丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖等凝胶颗粒构成，目前常用的葡聚糖凝胶有Sephadex和Sephacryl两大类。样品进入凝胶过滤柱后，由于分子量大的物料直径比凝胶颗粒孔径大，在凝胶颗粒间的空隙流动速率快而最先被洗脱，反之，分子量小的物料由于直径比凝胶颗粒孔径小可自由进出凝胶颗粒，在层析过程中，由一个凝胶颗粒进入另一个凝胶颗粒，流动速率慢而最后被洗脱。目前，凝胶层析技术，并已成功地应用于凝胶层析技术，并已成功地应用于纯化各种来源的蛋白质和多肽。郁晓盼[35]通过对比SephadexG-25和SephadexG-15凝胶层析处理超滤过的牛乳酪蛋白酶解液的存在的差异，发现2种处理液都有4个主要洗脱峰，同时SephadexG-15的分离度要高于SephadexG-25，这与2种凝胶的分离范围有关。Peng X等人[36]应用SephadexG-10凝胶过滤层析处理碱性酶水解后的乳清蛋白得到4个组分：＞40 ku，2.8～40 ku，0.1～2.8 ku和＜0.1 ku肽段。Tugba Bayram等人[37]现采用SephadexG-200柱层析处理乳清液得到3个组分，然后再将含有对乳球蛋白和α-乳球蛋白的组分经SephadexG-200柱层析，得到3个组分：第1组为牛血清白蛋白，第2组为β-乳球蛋白，第3组为小肽。

3.3 高效液相色谱（HPLC）

高效液相色谱法是借助高压将样品注入系统，各成分发生分离后，然后进入检测器检测，从而实现对样品的分离鉴定的分析方法。目前，应用于多肽分离纯化的高效液相色谱法主要分为多维高效液相色谱、反相高效液相色谱法、离子交换色谱与质谱联用法等。Tsopmo A等人[38]采用高效液相色谱法（HPLC）分离人乳水解物得到23个组分，其中色氨酸（Trp）、多肽HNPI和PLAPQA是主要成分。Hernandezledesma B等人[39]采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对发酵乳大部分活性组分的多肽进行了串联质谱测定，识别出了各种潜在的活性多肽。Jrad Z等人[40]在研究骆驼奶和骆驼初乳蛋白的生物活性片段中，采用反相高效液相色谱对蛋白质的水解物进行了表征，根据峰值发现大多数蛋白质被水解成小肽。

3.4 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOF-MS）

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱工作原理是样品与小分子基质均匀混合，在离子源室内，基质与样品之间发生电荷转移，使样品分子离子化；然后在电场作用下进入飞行时间质量分析器中加速，由到达检测器的飞行时间算出其质荷比，对样品进行定量定性分析[41]。其法操作简单且快速、精确度高、检测质量范围广，适合于各种多肽精确质量数测定。刘志东等人[12]采用MALDI-TOF-MS法鉴定出牛乳乳清蛋白中具有抗氧化活性的肽段序列为HIR。Homayounitabrizi M等人[19]利用MALDI-TOF-MS法测定出骆驼乳蛋白水解物中的3种多肽序列。Ibrahim H R等人[20]通过MALDI-TOF-MS法分析骆驼奶蛋白水解液中的活性肽，鉴定了多种质量范围在913～2 951 Da的抗氧化肽。

4 结语

乳源抗氧化肽在促进人体健康和预防疾病方面有较高的生物价值，可作为抗氧化剂应用到功能性食品或保健品中，可有效预防人体各种慢性疾病，也可以缓解相关疾病的症状，如肥胖、肿瘤、血管硬化、心脑血管疾病、炎症疾病等；此外，抗氧化肽还具有清除皮肤中的自由基，减少或预防皮肤老化的潜能。目前，许多研究者已经从乳源蛋白水解物中获得了很多抗氧化肽，并鉴定出了其结构序列，但是应用于工业生产和临床干预的抗氧化肽并不多。主要是与化学合成抗氧化剂相比，大多数乳源性抗氧化肽的活性和体内稳定性相对较低，其作用机制和构效关系的研究较少，目前已建立的构效关系模型缺乏代表性，无法解释所有类型抗氧化肽的作用机制，限制其进一步开发利用。因此，乳源蛋白抗氧化肽的定向修饰技术进一步改进和构效关系的进一步深入研究，将打破这些瓶颈问题，为乳源蛋白抗氧化肽的开发利用奠定基础。