IgA肾病患者全基因组N6-甲基腺嘌呤修饰差异表达图谱的研究

邱劲军 朱鹏 戴勇 曾启昂 王凯 李凤艳

1深圳市坪山区人民医院（广东深圳518118）；2深圳市人民院（广东深圳518020）；3河南大学护理与健康学院（河南开封475000）

IgA 肾病是一种比较常见的肾小球疾病，其免疫病理特点主要是IgA 免疫复合物附着于肾小球系膜区［1］。在我国，原发性肾小球疾病患者中约半数是原发性IgA 肾病［2］。多数患者患病10～20年最终发展成为终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）［3］。IgA 肾病临床表现差异比较大且缺乏特异性的治疗方法，导致IgA 肾病治疗困难、预后效果差。IgA 肾病的诊断现在主要依靠肾活检技术即组织病理学免疫病理分析［4］。肾活检是有创伤性的技术操作，存在一定的风险性。据统计，肾活检出血者比例高达1/5，少数患者由于采样引发并发症需要手术止血甚至行肾切除术［5］。而且，无症状的单纯镜检血尿患者是否需要肾活检也存在争议。因此，探索IgA 肾病的发病机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，有利于改善IgA肾病诊断有风险、治疗难和预后差的状况。

近年来，表观遗传学在疾病发病机制研究中的作用逐渐受到关注。表观遗传修饰不改变基因编码信息，通过环境因素和细胞内遗传物质的相互作用影响基因的表达和改变表观遗传性状，其主要方式包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、微小RNA 等修饰［6］。作为一种重要且稳定的表观遗传修饰，DNA 甲基化在调控基因表达、维持基因稳定性、胚胎发育等方面发挥重要的生物学作用，与发育以及多种疾病的发生都有密切的关系［7］。研究［8］发现，原核生物中N6-甲基腺嘌呤甲基化修饰能调控DNA 复制、修复、基因表达等重要的过程。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6mA）修饰是DNA 腺嘌呤碱基第6 位N 原子上存在的甲基化修饰。最新报道发现，6mA 在真核生物中也比较普遍存在，而且承担着重要的生物学功能。已有几篇研究论文揭示了真核生物如绿藻、线虫和果蝇基因组中存在6mA的修饰，因此其功能和调控机制引发了研究者更多的关注［7-9］。目前，关于6mA 修饰在IgA 肾病发病机制中的研究尚未见报道。随着第二代测序技术日臻发展和成熟，免疫共沉淀实验与高通量测序的整合（immunoprecipitation sequencing，IP-Seq），可在全基因组范围对蛋白结合的位点进行高效而准确的筛选与鉴定，同时也为研究的深入开展奠定基础。本研究通过使用N6-甲基腺嘌呤抗体富集高甲基化的DNA 片段，将富集的DNA 甲基化区域进行高通量测序，通过生物信息学分析IgA 肾病患者和健康者之间的腺嘌呤甲基化修饰模式的差异，深入探讨IgA 肾病的发生、发展机制，进而为IgA 肾病的诊断和治疗寻找新靶标。

1 资料与方法

1.1 一般资料2017年6月至2018年4月，中国人民解放军第九二四医院肾病中心收治的原发性IgA 肾病患者10 例（经组织病理学免疫病理分析确诊），其中男6 例，女4 例，年龄（41.8 ± 12.1）岁，所有患者在肾活检时均未长期服用糖皮质激素和（或）免疫抑制剂。健康对照者10 例，其中男6 例，女4 例，年龄（43.7 ± 10.3）岁，参与者均无高血压、糖尿病、慢性肾炎病史，均无蛋白尿。抽取每例IgA 患者和健康者空腹外周静脉血1 ～2 mL，EDTA抗凝后置于-80 ℃保存。本研究经过医院伦理委员会批准，所有参与者签订知情同意书。

1.2 DNA 样本制备将样本分为IgA 肾病组（编号为B01）和正常对照组（编号为N01）两组样本。分别取适量的血样品，用DNA 提取试剂盒。采用NanoDrop 2000 微量分光光度计检测纯度（OD260/OD80=1.8～2.0）；Qubit 荧光光度计检测浓度（≥1 ng/μL）；琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1%、电压120 V、时间45 min）检测DNA 完整性（100～500 bp）。

1.3 建库和测序随机打断DNA，将一部分DNA作为比对（Input），一部分DNA 用来免疫共沉淀（IP），采用anti-6mA antibody 进行免疫共沉淀反应特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段，对共沉淀获得的目标序列末端修复，加碱基A、加测序接头，进行PCR 扩增，最后进行片段筛选获得目标长度的6mA-IP-seq 文库，可得B01input、B01IP、N01input 和N01IP 4 个文库。构建好的文库经过文库质控合格后，进行测序。HiSeq 测序所得序列，通过去低质量、去接头等过程完成数据处理得到可信的目标序列，将过滤后的目标序列用于后续的分析。笔者对原始序列进行过滤，得到高质量的Clean Reads，再进行后续分析。

1.4 生物信息学分析利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行富集分析：基因本体（gene ontology，GO）分析对甲基化明显差异的基因分别进行分子功能、生物学过程、细胞组分富集；KEGG 进行信号通路分析，将分析结果进行Fisher 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IP-Seq 分析结果Peaks 是6mA的分布热点，Peaks的显著程度代表Peaks 可信程度的指标，pvalue 越小显著性越大。Peaks 数目用-LOG10（qvalue）计算，本此实验共测得IgA 肾病组61 465个6mA 位点（peaks）的-Log10（qvalue）＞20，见表1、图1A。6mA的热点（peaks）主要分布在基因上游2K、5-UTR、外显子、内含子、3-UTR、下游2K 和基因间区，其中内含子上分布最多，见图1B。6mA表达上调基因有2 550 个，6mA 表达下调基因有1 563 个，见图1C。

2.2 差异甲基化基因的GO 富集分析和KEGG信号通路分析结果

2.2.1 差异甲基化基因的GO 富集分析利用DAVID 在线数据库对差异基因进行GO 分析发现，其中包括生物过程，细胞成分和分子功能，见图2。

甲基化差异基因主要涉及分子功能包括蛋白激酶抑制剂的活动、蛋白激酶C 抑制剂活性、N，N-二甲基苯胺单氧酶的活性、核酸绑定、酶抑制剂的活动、脱氧核糖核苷激酶活性、凝血酶受体的活动、菲醌-环氧化物水解酶活性、核内小RNA 绑定、序列特异性DNA 结合转录因子的活性、核酸结合转录因子的活性、RNA 聚合酶Ⅱ转录序列特异性DNA 结合转录因子的活性、生长激素受体结合、限制脱氧核糖核酸内切酶活性等，见表2。

表1 IgA 肾病患者和正常对照者的Peaks 扫描结果Tab.1 The Peak calling results of IgAN and NC

差异基因主要富集在线粒体电子传递、调节肽酶活性、调节磷酸的运输、对雌激素的刺激做出反应、正调节ATP 生物合成的过程、正调节核苷代谢过程、肾元小管形态发生、肾元上皮细胞形态发生、呼吸电子传递链、正调节有丝分裂细胞周期阶段过渡、软骨聚合、肾小管形态发生、反应流体剪切应力等生物学过程，见表3。

图1 IP-Seq 分析结果Fig.1 IP-Seq analysis results

图2 GO 聚类分析结果对比图Fig.2 Comparison of GO classification

表2 差异基因的生物过程Tab.1 The list of biological processes

在细胞组成方面，差异基因主要涉及线粒体呼吸链复合体Ⅳ、多囊肾蛋白复合体复杂、核常染色质、细胞器内膜、运动型的初级纤毛、抗肌萎缩相关糖蛋白复合体、应力纤维、IgM 免疫球蛋白复合体、肌动蛋白丝、信使核糖核蛋白复合体、γ微管蛋白小复合体、IgA 免疫球蛋白复合体、肌动球蛋白、染色体着丝粒核心区域、高尔基体相关的泡膜等细胞组件，见表4。

2.2.2 差异甲基化基因的KEGG 信号通路富集分析通过KEGG 信号通路富集分析发现，差异基因主要富集在胞吞、刺激神经组织配体-受体作用、钙离子信号通道、粘着斑等通路，其中胞吞代谢途径富集倍数最高，此通路中MHC、TGB1、PIP5K、PLD1、RAB、CLB 等基因的6mA 表达水平显著下调，见表5 和图3、4。

3 讨论

IgA 肾病是国内较常见的慢性肾脏疾病之一，由于其临床表现多样化，多数较隐匿，有些患者仅表现为单纯镜检血尿或蛋白尿［5］。若能早期诊断IgA 肾病，从发病初期对其采取相应的干预策略，多数IgA 肾病在治疗后，系膜细胞增生、肾小球血管袢坏死、间质纤维化程度均会缓解，从而避免ESRD的发生［9］。尽管肾活检是诊断IgA 肾病的金标准，但是对无症状的单纯镜检血尿者行肾活检仍存在非议，且可能因此造成不必要的损伤［5］。由于近年来高通量技术的快速发展，表观遗传修饰作为基因表达的重要机制逐渐被人们所认识，DNA 甲基化在疾病发生发展中的作用逐渐受到关注。目前关于甲基化的研究焦点主要集中在5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）甲基化修饰参与疾病的发生机制。大量研究［10-11］表明，基因HLA的5′-甲基胞嘧啶异常甲基化与肾细胞癌、肾病细胞瘤、I 型糖尿病肾病等肾脏疾病的发生发展密切相关。最新研究［12］发现，腺嘌呤的N6-甲基修饰在DNA 复制、修复、基因表达调控等方面发挥重要的功能。目前，关于6mA 修饰在IgA 肾病发病机制中的研究尚未见报道。笔者推测6mA 修饰可能与IgA 肾病有一定的相关性。本研究通过6mA-IPSeq技术绘制全基因组腺嘌呤甲基化水平的图谱，深入了解IgA 肾病的发生、发展机制，可能为IgA 肾病的早期诊断、干预和治疗带来新的契机。

表3 差异基因的分子功能Tab.3 The list of molecular function

表4 差异基因参与细胞组成Tab.4 The list of cellular component

表5 差异基因的KEGG 富集通路列表Tab.5 The list of KEGG pathway richness

图3 KEGG 信号通路富集图Fig.3 Richness of KEGG pathway

图4 胞吞信号通路图Fig.4 Endocytosis signaling pathway

本研究应用免疫共沉淀联合高通量测序技术检测到IgA 肾病组中6mA 位点61 465 个，其中上调基因2 550 个，下调基因1 563 个。从结果显示，越长的染色体上分布的Reads 数目越多，且分布频率越高。6mA 甲基化热点（peaks）主要分布在基因上游2K、5-UTR、外显子、内含子、3-UTR、下游2K 和基因间区等七个区域，大部分6mA 分布在内含子上。

从GO 分析结果来看，6mA 差异基因主要参与调控遗传物质DNA 复制、转录、合成、修复及转座等分子功能。近期研究［12］也曾报道，6mA 是一种存在比较广泛的修饰，它在调控DNA 复制、修复、转座、转录中起着重要作用。而且，齐素文等［13］通过对15 例IgA 肾病患者和15 例健康人外周血单核细胞（PBMC）的H3K4 甲基化进行染色质免疫沉淀分析发现IgA 肾病患者基因组蛋白H3K4 甲基化与健康对照组有显著差异，H3K4 甲基化可激活基因转录。由此推断，6mA 在IgA 肾病中也发挥调控遗传物质DNA 复制、转录和修复等作用。本实验结果显示，6mA 差异基因主要富集在调节肾小管和上皮细胞形态发生、ATP 生物合成的过程、细胞周期等生物过程。有研究证实klotho 基因启动子超甲基化影响klotho 基因的表达异常，多名研究者在此基础上发现慢性肾脏疾病患者肾组织和PBMCklotho 基因启动子甲基化水平的升高与肾小球滤过率及肾间质纤维化有一定的关系［14-15］。肾小管上皮细胞是肾小管间质最主要的固有细胞，细胞膜上有多种转运蛋白，依赖ATP 供能介导物质转运，包括介导多种内源性毒素和外源性化学物质的排泄，从而避免组织受多种有毒物质的侵害［16］。 IgA 肾病多伴有肾小管间质损伤，严重的小管间质损伤是病情快速进展并最终导致终末期肾功能衰竭的重要原因［17］。本研究通过KEGG 信号通路富集分析发现，6mA 甲基化差异基因主要富集在胞吞、刺激神经组织配体-受体作用、钙离子信号通道、粘着斑等通路，其中胞吞代谢途径富集倍数最高，此通路中MHC、TNFRSF、CRHR2、FSHR、PTHR1、CALCR 等基因的6mA 表达水平显著下调。SUI 等［18］通过比较膜性肾病患者和正常健康人的基因5mC 甲基化程度，从108 个差异基因中筛选出5 个与膜性肾病有关的基因，这5 个基因均表现为低甲基化。近年研究表明，在近端小管mega1in-cubilin 受体介导的胞吞作用可以重吸收肾小球滤过大部分的蛋白质［19］。由本实验结果推测，胞吞代谢途径相关基因的6mA 表达异常可能导致胞吞作用无法重吸收肾小球滤过的蛋白质。那么，IgA 肾病的发生、发展可能与胞吞功能失调有关，且可能与胞吞信号转导通路某些基因6mA 表达下调有关。由此，进一步推测6mA 甲基化在IgA 肾病病程中发挥了重要的作用。

综上所述，本研究利用免疫共沉淀实验与高通量测序的整合技术，在全基因组范围对IgA 肾病DNA N6-甲基腺嘌呤甲基化区位点进行筛选与鉴定，初步筛出了一系列与IgA 肾病相关的差异甲基化基因。在KEGG 信号通路中，胞吞信号通路富集倍数最高，此通路中MHC、TGB1、PIP5K、PLD1、RAB、CLB 等基因的6mA 表达水平显著下调。这些基因6mA 表达失调可能与IgA 肾病的发生、发展有密切相关性。下一步将结合生物信息学筛选出可能有意义的基因，并对其甲基化程度及位点进行进一步的验证，以期发现与IgA 肾病相关的基因，为IgA 肾病的预测和诊断提供新的思路和线索。