不同均质工艺处理对巴氏杀菌乳脂肪球膜蛋白质组成的影响

张瑞明，刘梦霞，王 祎，刘晓辉，于景华,*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，北京 101107）

乳脂肪是牛乳的主要成分之一，在体系中以脂肪球的形式存在[1-2]。脂肪球表面由成分复杂的脂肪球膜[3]包裹，脂肪球膜主要由蛋白质、脂类等组成[4]，这些蛋白质以及脂类具有重要的功能[5]。在贮存过程中，脂肪球一直进行不规则的布朗运动，由于热运动相互碰撞时，在脂肪球膜处会发生相互渗透，导致脂肪球之间相互融合，进而形成更大的脂肪球[6]，由于重力沉降作用和油-水界面密度差，便会产生脂肪上浮现象，最终影响产品品质与货架期。

脂肪球的粒径大小可以反映脂肪稳定性，通常脂肪球的平均直径小于0.8 μm时，其上浮速度慢[7]。减小脂肪球直径常用的方法是均质，在均质过程中，通过湍流、剪切力和气穴现象的作用，使得脂肪球直径迅速变小[8]。均质压力需要适当[9]，因为均质会导致脂肪球膜上蛋白含量、种类以及结合方式发生变化[10]，从而影响牛乳的胶体和功能特性[11]。

脂肪球膜蛋白在乳相中含量极少[12-13]，通过蛋白质组学方法鉴定出蛋白质的种类有500多种[14]。丰度最高的有8 种[15]，其中6 种是糖蛋白，包括黏液素1、黄嘌呤氧化还原酶、黏液素15（又称组织糖蛋白高碘酸薛夫III）、组织糖蛋白高碘酸薛夫IV（cluster of differentiation 36，CD36）、嗜乳脂蛋白和乳凝集素（又称组织糖蛋白高碘酸薛夫6/7）[16]，另外两种都是分子质量更小的非糖基化蛋白，分别为脂肪分化相关蛋白和脂肪酸结合蛋白[17-18]。这些蛋白虽然量少，却具有重要的功能，如黄嘌呤氧化还原酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，XO）在乳腺的发育、肠道的抗菌和组织损伤中具有一定的作用[19]。嗜乳脂蛋白（butyrophilin，BTN）具有免疫调节作用[20-21]等。同时这些蛋白对维持体系的稳定性也发挥着不可忽视的作用，本实验通过研究在不同均质条件下脂肪球膜蛋白组分的变化，并与天然脂肪球膜蛋白的组成进行比较，确定形成乳稳定体系所需脂肪球膜蛋白组成，以期为生产中均质工艺参数调整，提高乳体系稳定性，改善纯乳制品的货架期内脂肪上浮的缺陷提供可靠的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

经过标准化处理的鲜牛乳 沧兴牧业有限公司。

氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钠、咪唑、乙醇、乙二胺四乙酸、硫酸铜、硫酸钾（均为分析纯）天津市化学试剂一厂；氯化钾（分析纯） 天津市景田化工有限公司；硼酸（分析纯） 天津市百世化工有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（纯度＞93%） 美国Genview公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；甲酸（纯度＞93%） 上海紫一试剂厂；乙腈（色谱纯） 天津赛孚瑞科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；FE20Mettler pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TDZ5-WS离心机、台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；752紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BSA124S电子天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司；DYCZ-24DN型电泳仪 北京六一仪器厂；DL-600C电泳仪电源 北京东林昌盛生物科技有限公司；TW-Basic均质机 上海沃迪自动化装备股份有限公司；Turbiscan Lab稳定性分析仪 法国Formulation公司。

1.3 方法

1.3.1 巴氏杀菌乳的制备

将标准化的鲜牛乳置于水浴锅中预热，在固定均质压力的条件下设置不同的预热温度，分别为50、60、70 ℃；在固定预热温度的条件下设置不同的均质压力，分别为20、30、40、45 MPa；均质后于水浴锅中灭菌，条件为75 ℃、15 s[22]；灭菌后于冰水浴中快速降温后置于4 ℃贮存。

1.3.2 巴氏杀菌乳稳定性系数的测定

采用Turbiscan Lab稳定性分析仪对样品进行稳定性测试。对于透明体系，选取透射光的透过率为指标，不透明体系则选取背散射光的反射率为指标（巴氏杀菌乳属于不透明体系，因此选择的稳定性评价指标为反射率）。稳定分析仪给出的评价指标是样品观察时间内背散射光的平均变化率，也称稳定性系数（dynamic stability index，TSI）。TSI与体系的稳定性呈负相关，即TSI越小，体系越稳定；TSI越大，体系越不稳定。

测量时，取样品约20 mL加入样品池，加盖后置于仪器的样品槽中，设定60 min扫描一次，共扫描7 h，即可直接得到样品的TSI。

1.3.3 乳脂肪球膜蛋白的提取

乳脂肪球膜蛋白的提取方法参考Le[23]和Zamora[24]等的方法并略作修改。将牛乳预热至3 6 ℃后，4 000 r/min离心25 min收集上层乳脂；再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，以去除脱脂乳中的酪蛋白（casein，CN）、乳清蛋白（lactalbumin，La）、乳糖。PBS与乳脂肪以5∶1（V/V）混合，39 ℃轻微振荡水浴30 min后，4 000 r/min离心30 min后收集上层乳脂；PBS重复洗涤乳脂两次，再用蒸馏水洗涤一遍；将洗涤干净的乳脂与SDS-Tris溶液1∶1（m/m）混合，60 ℃轻微振荡水浴30 min后，4 ℃、5 000×g离心15 min，下层液体即为含有乳脂肪球膜蛋白的样品。

1.3.4 乳脂肪球膜蛋白质的SDS-PAGE定性分析

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）参照de Feijter等[25]的方法，采用质量分数12%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE分析，还原胶与非还原胶的配制参照赵亭亭等[26]的方法。

1.3.5 液相色谱-质谱法测定乳脂肪球膜蛋白组成及含量

1.3.5.1 蛋白质定量

使用8 mol/L尿素复溶1.3.3节中提取的乳脂肪球膜蛋白样品，用考马斯亮蓝法对待测样品进行蛋白质量浓度测定：1）标准曲线的制作：配制0.1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液，进行标准曲线的制作[27]。2）蛋白质含量的测定：取1 mL待测洗液与5 mL考马斯亮蓝G-250显色剂混合均匀，静置5 min后于595 nm波长处测吸光度，20 min内测完。调整洗液中蛋白质量浓度，使所有样品蛋白质量浓度均为3 mg/mL，备用。

1.3.5.2 SDS-PAGE鉴定溶解效果

SDS-PAGE方法同1.3.4节。

1.3.5.3 FASP法酶解蛋白质

液相色谱-质谱（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）联用的样品采用超滤辅助样品制备（filter-aided sample preparation，FASP）法[28-29]酶解处理。从1.3.3节提取的脂肪球膜蛋白样品中取出100 μg蛋白质使用FASP法进行蛋白质酶解，具体步骤如下：向样品中加入与蛋白样品相同体积的8 mol/L尿素；加入DL-二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），使DTT终浓度达到10 mmol/L，然后在37 ℃条件下反应2.5 h；加入碘乙酰胺（iodoracetamide，IAA）至终浓度50 mmol/L，避光反应40 min；转至3K超滤管中12 000×g下离心，之后弃掉滤液；加入400 μL 8 mol/L尿素，12 000×g下离心，弃掉滤液，重复两次；向超滤管中加入400 μL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液，12 000×g下离心，弃掉滤液，重复3 次。向超滤管中加入200 μL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液；向超滤管中以m（样品）∶m（酶）＝50∶1加入胰蛋白酶，于37 ℃摇床酶解16 h；在4 ℃、12 000×g条件下离心，收集滤液，冷冻干燥。

1.3.5.4 LC-MS/MS检测参数及样品编号

采用Nano Acquity高效液相色谱，色谱柱：C18（15 cm×75 µm，3 µm）；分离条件：上样量为2 µg；流动相A为0.1%（体积分数，后同）甲酸-水溶液；流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脱，0～10 min 95% A，10～140 min 90% A，140～158 min 70% A，158～160 min 55% A，160～165 min 5% A，165～180 min 95% A；流速400 nL/min。

串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）分析采用Scientific Q Exactive质谱仪；喷雾电压：2.0 kV；毛细管温度：320 ℃；S-lens RF水平：55；分辨率：一级70 000，m/z 200，二级17 500，m/z 200；母离子扫描范围：m/z 300～1 800，子离子从m/z 100开始扫描；MS1 AGC目标：3e6，离子注入时间：60 ms，MS2 AGC目标：5e4，离子注入时间：80 ms；离子筛选窗口：2.2 m/z；碎裂模式：HCD；能量NCE 27；Data-dependent MS/MS：Top 20；动态排除时间：30 s。

取6 个巴氏杀菌乳样品进行LC-MS/MS检测，其样品编号和相应制备方法为：L1（预热温度60 ℃、均质压力20 MPa）、L2 （预热温度60 ℃、均质压力30 MPa）、L3（预热温度60 ℃、均质压力40 MPa）、 L4（预热温度60 ℃、均质压力45 MPa）、L5 （预热温度50 ℃、均质压力40 MPa）、L6（预热温度70 ℃、均质压力40 MPa）。

1.3.5.5 LC-MS/MS蛋白质组学分析

使用蛋白质组学分析软件Proteome Discoverer 2.1对采集的数据进行蛋白质定性与定量分析，检索数据库采用Uniprot网站下载的Bos Taurus全库（数据库编号9913），同时为了去除假阳性结果，数据检索采用正反库检索策略，检索结果在多肽层次采用伪发现率（false discovery rate，FDR）≤1%筛选条件，在蛋白层次采用Q Value≤1%的筛选条件。

1.4 数据处理与分析

使用Turbiscan Lab全能稳定分析仪的TLAB EXPERT软件采集数据，采用SPSS软件分析数据，并用Origin 8.0软件进行数据拟合和作图。

2 结果与分析

2.1 不同均质工艺条件对巴氏杀菌乳TSI的影响

图1 不同预热温度对乳脂肪TSI的影响Fig. 1 Effect of different preheating temperatures on turbiscan stability index of milk fat

TSI与样品稳定性呈负相关，即TSI越大表示样品稳定性越差。由图1可以看出，不同均质压力下，预热温度分别为50、60 ℃和70 ℃时，60 ℃巴氏杀菌乳的脂肪稳定性均表现最好。

图2 不同均质压力对乳脂肪TSI的影响Fig. 2 Effect of different homogenization pressures on turbiscan stability index of milk fat

由图2可以看出，不同预热温度下，均质压力分别为20、30、40 MPa和45 MPa时，40 MPa巴氏杀菌乳总体脂肪稳定性最好。

因此，从TSI来判断，预热温度60 ℃、均质压力40 MPa时，巴氏杀菌乳脂肪稳定性最好。

2.2 乳脂肪球膜蛋白质的SDS-PAGE定性分析结果

由图3可知，生牛乳中XO、CD36、BTN在非还原条件下不存在，在还原条件（添加β-巯基乙醇）下出现，说明这些脂肪球膜蛋白可能是通过二硫键作用力结合在脂肪球膜上；泳道2样品XO、CD36、BTN、ADPH在非还原条件下不存在，而在还原条件下存在，说明XO、CD36、BTN、ADPH这些蛋白通过二硫键形式结合存在；与泳道1样品对比可知，预热后均质导致部分CN、La参与了脂肪球膜蛋白的组成，这与Ye Aqian等[30]的结论一致。而且均质后，αs1-CN、β-CN的含量明显增多，这可能是其参与了脂肪球膜的再构建，对再构建体系的稳定性发挥作用。经过均质处理的泳道3～8样品在非还原条件下存在XO、BTN、ADPH，与泳道1、2样品对比，可能是均质导致一部分XO、BTN、ADPH之间的二硫键作用力减弱，以非二硫键作用力存在于脂肪球膜上。非还原条件下的泳道1～8样品，在浓缩胶的上样孔处和浓缩胶与分离胶分界处有明显的大分子物质堆积；而在还原条件下，仅泳道1、2样品有大分子物质堆积，泳道3～8样品没有大分子物质堆积，证明未均质的牛乳脂肪球膜蛋白之间除了二硫键作用力外，还有其他的连接方式，使其成为大分子复合物，在均质后这种作用力被消除。

图3 牛乳脂肪球膜蛋白质SDS-PAGE分析图谱Fig. 3 SDS-PAGE patterns of MFGM proteins under non-reducing and reducing conditions

2.3 LC-MS/MS检测乳脂肪球膜蛋白结果

2.3.1 蛋白质组学分析结果

表1 不同均质工艺条件处理的巴氏杀菌乳脂肪球膜LC-MS/MS鉴定的蛋白总数量Table 1 Number of MFGM proteins identified by LC-MS/MS from different homogenized pasteurized milks

通过LC-MS/MS蛋白质组学分析方法，检测不同均质工艺条件对脂肪球膜蛋白种类的影响。由表1、图4可知，L1～L6样品总共检测到蛋白质467 个，比较L1～L4样品，预热温度60 ℃，不同均质压力的脂肪球膜蛋白种类数目接近，差异蛋白数量较少，分别为41、32、11、13 个，因此影响脂肪稳定性的蛋白主要表现在特定蛋白质的含量差异上。比较L3、L5、L6样品，均质压力为40 MPa时不同预热温度处理的脂肪球膜蛋白种类数目有差异，随着预热温度的升高蛋白种类减少，分别为27、91、7。但是通过基因本体论（gene ontology，GO）注释分析，差异蛋白的分子功能并无特异性，有结合功能的蛋白质在3 种样品中都存在，因此影响脂肪稳定性的蛋白主要表现在特定蛋白质的含量差异上。

图4 不同均质压力处理的巴氏杀菌乳脂肪球膜蛋白（A）和不同预热温度处理的巴氏杀菌乳脂肪球膜蛋白（B）韦恩图Fig. 4 Venn diagrams for MFGM proteins in pasteurized milk treated at different homogenization pressures (A) and temperatures (B)

2.3.2 牛乳脂肪球膜蛋白构成LC-MS/MS分析结果

图5 不同预热温度对高丰度（A）和低丰度（B）再构建乳脂肪球膜蛋白的影响Fig. 5 Effects of different preheating temperatures on composition of high- (A) and low-abundance (B) reconstituted MFGM proteins

由图5可知，预热温度60 ℃时，XO、BTN、ADPH、乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）、β-lg、κ-CN、αs2-CN这几种蛋白质含量最低，可能是这几种脂肪球膜蛋白在预热60 ℃时的结合力最弱，在提取脂肪球膜蛋白过程中损失最多，Lf、β-lg、κ-CN、αs2-CN这几种蛋白质在预热60 ℃时结合到脂肪球膜上的量最少；MUC1、αs1-CN、β-CN、BSA在预热60 ℃时的含量最高，说明脂肪球膜蛋白MUC1在预热60 ℃时的结合力最强，最稳定，而αs1-CN、β-CN、BSA结合到脂肪球膜上的量最多，结合最稳定，结合2.1节稳定性分析结果推测，可能是αs1-CN、β-CN、BSA参与了脂肪球膜的再构建，对脂肪球稳定性起到关键作用；FABP、PAS6/7、Ig的含量随着预热温度的升高而减少，说明脂肪球膜蛋白FABP、PAS6/7有热不稳定性，温度升高后结合力减弱导致有所损失，而结合到膜上的Ig会随着温度的升高而脱落。α-La、CD36的含量随着预热温度的升高而增多，说明脂肪球膜蛋白CD36随着预热温度的升高结合作用力更稳定，CD36随预热温度的升高损失得越少，而α-La随着温度的升高结合到脂肪球膜上的量增多。通过蛋白丰度的变化分析可知，预热处理后脂肪球膜被破坏，会有部分膜组分流入乳相，同时也有乳蛋白结合到膜上。

图6 不同均质压力对高丰度（A）和低丰度（B）再构建乳脂肪球膜蛋白的影响Fig. 6 Effect of different homogenizations pressures on composition of high- (A) and low-abundance (B) reconstituted MFGM proteins

由图6可知，4 种样品中的XO、PAS6/7、BTN、ADPH、FABP、Lf和β-lg这7 种蛋白质含量的变化趋势一致，随均质压力的增大，先减少而后增加，且在均质压力40 MPa时蛋白质含量最低。由2.1节结果可知，40 MPa时的巴氏杀菌乳脂肪是最稳定的，说明这些蛋白在此压力下含量最适宜，可能是这些蛋白此时能够与其他蛋白相互作用达到最佳作用效果，使得脂肪球最稳定；XO和BTN两种蛋白质含量变化趋势一致，也证明了Mulder[31]的结论：XO和BTN之间通过二硫键作用力形式结合存在。Lf、β-lg与XO、PAS6/7、BTN、ADPH、FABP的变化趋势一致；而BSA在均质压力40 MPa时含量最高（图6A），因此BSA可能是影响脂肪稳定性的关键因素；α-La和CD36这两种蛋白随着均质压力的增加而减少（图6B），说明均质破坏了这两种蛋白的结合作用力，使其容易从膜上脱落损失。

3 结 论

通过测定TSI确定了在预热温度为60 ℃、均质压力为40 MPa时的巴氏杀菌乳脂肪稳定性最佳。通过SDS-PAGE分析发现，XO、CD36、BTN、ADPH通过二硫键作用力存在于脂肪球膜上；均质处理导致一部分XO、BTN、ADPH蛋白质之间的二硫键作用力减弱，以非二硫键作用力作用形式存在于脂肪球膜上；预热和均质处理会导致CN、La参与脂肪球膜的组成；未均质的牛乳脂肪球膜蛋白之间除了有二硫键作用力以外，还有其他的连接方式，使这些蛋白质成为大分子复合物，而均质后这种作用力被消除。

通过LC-MS/MS蛋白质组学分析方法检测不同均质工艺条件对脂肪球膜蛋白种类的影响：预热温度50～70 ℃、均质压力20～45 MPa范围内，均质压力对巴氏杀菌乳脂肪球膜蛋白种类无显著影响；预热温度对巴氏杀菌乳脂肪球膜蛋白种类有影响，但这些差异蛋白无特殊分子功能。因此影响脂肪稳定性的蛋白主要表现在特定蛋白质的含量差异上。

通过LC-MS/MS鉴定分析不同均质工艺处理的乳脂肪球膜蛋白含量变化情况：在均质压力40 MPa、预热温度60 ℃时，XO、BTN、ADPH、Lf、β-lg、κ-CN、αs2-CN这几种蛋白质的结合力最弱；而MUC1、αs1-CN、β-CN、BSA的结合最稳定，说明这几种蛋白质对脂肪球膜稳定性方面起到关键作用；脂肪球膜蛋白FABP、PAS6/7具有热不稳定性；脂肪球膜蛋白CD36随着预热温度的升高结合作用力更稳定，而α-La随着温度的升高结合到脂肪球膜上的量增多；XO和BTN之间通过二硫键作用力形式结合存在；BSA在均质压力40 MPa时含量最高，可能是影响脂肪稳定性的关键因素。