归肾经方对慢性肾纤维化大鼠β-Catenin、Col1、LN 表达的影响＊

郑小利，黄招兰，胡姗姗，艾 萌，吴文莉，谢 岱，马 威＊＊

（1.武汉科技大学医院 武汉 430065；2.武汉市中西医结合医院 武汉 430030）

对治疗《中医内科学》中五脏分类疾病及肢体经络病的代表方与疾病归经的相关分析发现[1,2]，这些教材所用的经方（或验方）非常强调病变部位与所选药物归经的一致性，因此推测在辨证论治原则指导下，根据病位，归经选药组方可以提高中药疗效[3]。本研究是在经验方肾衰Ⅰ号的基础上，选择归肾经的药物组方，观察其干预5/6 肾切除大鼠肾纤维化进程的疗效及对Wnt经典信号基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠118 只（湖北省动物中心，合格证编号：4200601113、4200695028），体质量200±10 g，动物实验完成于武汉市第一医院SPF 动物室（SYXK（鄂）2014-030），动物设施使用编号：No.00070368。动物饲喂已辐照灭菌的维持饲料（北京华阜康公司），自由饮食，饮去离子水。动物室内12 h明暗交替，温度21±1℃，湿度50%±10℃。

1.1.2 主要仪器

OLYMPUS AU2700 全自动生化分析仪、Sysmex-1800i全自动血球分析仪、图像处理采用Biorad凝胶成像系统（美国伯乐公司）、PCR 仪（美国Thermo 公司），动物代谢笼。

1.1.3 主要试剂

双缩脲法测定总蛋白（Total Protein，Tp）试剂（批号：L1306054）、酶法测定肌酐（Creatinine，Cr）试剂（批号：D1308083）均购于上海长征公司；紫外-谷氨酸脱氢酶法检测尿素（Blood Urea Nitrogen，BUN）试剂（批号：20131032）购于上海科华公司；尿蛋白检测试剂（批号）购于北京利德曼生化股份有限公司。Fermatas 分子生物学试剂，引物合成于武汉奥科鼎盛生物科技有限公司；抗体购于Abcam 公司，层粘连蛋白（laminin，LN）抗体（ab11575），胶原蛋白Ⅰ（Collagen，Col1）抗体（ab21287），β-Catenin，抗体（ab16051）。

1.1.4 治疗药物

治疗用中药饮片购于我院草药房，由湖北天济中药饮片公司提供。经验方肾衰I 号（黄芪30 g、太子参15 g、白术12 g、茯苓12 g、枸杞12 g、生地12 g、红花12 g、益母草12 g、川牛膝12 g、赤芍12 g、当归12 g、丹参12 g、木香6 g、厚朴12 g、熟大黄12 g）为B组，全部药物均归肾经处方（黄芪30 g、西洋参15 g、山药12 g、泽泻12 g、枸杞12 g、生地12 g、鸡血藤12 g、益母草12 g、川牛膝12 g、丹皮12 g、阿胶12 g、熟地12 g、沉香6 g、砂仁12 g、熟大黄12 g）为C 组，全部药物均不归肾经处方（黄芪30 g、太子参15 g、白术12 g、薏苡仁12 g、麦冬12 g、玉竹12 g、红花12 g、泽兰12 g、川芎12 g、赤芍12 g、当归12 g、丹参12 g、木香6 g、厚朴12 g、熟大黄12 g）为A组。三首组方均为195 g·剂-1，按常规方法煎煮，浓缩至1.5 g·mL-1，按体重换算后各组动物灌胃剂量为17.25 g·kg-1大鼠（相当于成人剂量）。

1.2 实验步骤

1.2.1 5/6肾切除法制备肾纤维化模型[4]

上述动物适应性喂养5天后随机分为2组：假手术组24 只和模型组94 只。造模动物3%戊巴比妥50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，从左腹部切口打开腹腔，动脉夹夹住左肾蒂后切除肾上下极（共切除2/3），以明胶海绵压迫止血3 min，复位肾脏，逐层缝合，连续腹腔注射青霉素3 天。14 天后行第2 次手术，背部右侧切口摘除右肾。假手术组采取同样步骤暴露肾脏。自由饮食60天后（期间造模组死亡动物15只），分别随机从2组中各取12 只动物，代谢笼收集24 h 尿液，记录尿液容积并检测尿蛋白浓度以计算24 h尿蛋白含量；禁食12 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后腹主动脉采血，取肾组织，一部分4%多聚甲醛固定后备用，剩下分装后-80℃保存备用。

1.2.2 分组治疗

剩余造模组动物67只，按体重采用分层随机方法分为4 组：A 组16 只（灌胃A 方），B 组17 只（灌胃B方），C组17只（灌胃C方），模型组17只与假手术组动物按相同剂量灌胃生理盐水，连续60天。按1.2.1方法收集标本。

1.3 指标检测

1.3.1 常规方法石蜡包埋，切片，HE染色。

1.3.2 Masson染色

用千屏软件对Masson 三色法染色样本进行图像分析，每张肾组织样本连续取十个视野图像，其中胶原纤维呈绿色为阳性，用IPP6.0软件计算上述10个图片阳性面积平均灰度值值为该样本结果。各组与假手术组阳性面积比例为该组胶原相对含量。

1.3.3 生化检测

肝素抗凝血离心后分离血浆，以全自动生化分析仪检测血BUN、Cr、Tp；EDTA 抗凝血混匀后以全自动血球分析仪检测Hb；所收集的24 h尿液记录尿量后，混匀取适量以全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白含量。

1.3.4 Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA 表达检测

取各组冰冻保存肾组织50 mg，分别加1 mL Trizol提取总mRNA；经核酸含量检测，调整样本量逆转录合成cDNA；分别取1 μL 分cDNA 进行各指标PCR。Wnt2上游引物5'-TCAGGAAAACAGGCGACTATCTC-3'，下游引物5'-GCCTCTCCCACAACACATAACTT-3'，退火温度60℃，产物长度257 bp；GSK-3β上游引物5'-CATCCTTATCCCTCCTCACG-3'，下 游 引 物 5' -TATTGGTCTGTCCACGGTCT-3'，退火温度55℃，产物长 度96 bp；β-Catenin 上 游 引 物5'-CTTGGCTATTACGACAG ACT-3'，下 游 引 物5'-CAGCACCTTCAGCACTC-3'，退火温度55℃，产物长度96 bp；LN物长上游引物5'-ccccaatctctgcgaaccat-3'，下游引物5'-agaggattgcaagcaca cga-3'，退火温度60℃，产物长度216 bp；Col1a1 上游引物5'-caggctggtgtgatggg att-3'，下游引物5'-cacctcgttctccagccttt-3'，退火温度58℃，产物长度73 bp；GAPDH 上游引物5'-GGTGCTGAGTATGT CGTGGAG-3'，下 游 引 物5'-CAGTCTTCTGAGTGG CAGT GAT-3'，退火温度56℃，产物长度98 bp；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（120V，50 mA），Biorad 成像系统扫描成像，用ImageJ软件进行灰度分析，并分别与各自GAPDH结果进行比较计算各组指标表达相对含量。

1.3.5 免疫组织化学方法检测LN、COL1、β-Catenin表达

经烤片、脱蜡、抗原修复、灭火内源性过氧化物酶、山羊血清封闭抗原、一抗孵育（LN或COL1，1∶80稀释；β-Catenin，1∶100稀释）过夜、二抗标记、DAB染色、苏木素复染及中性树胶封片完成IHC染色；结果判断：以棕褐色为阳性表达。用千屏图像采集系统连续采集每张玻片连续10个视野图像，IPP6.0软件计算每张图片阳性表达的灰度值，再计算该样本的平均灰度值。以空白组（LN、Col1、β-Catenin）表达为1，并计算各组相对表达值。

1.4 统计分析

统计分析用SPSS19.0 统计分析软件进行，先进行正态性检验，若不符合正态分布则进行数据标准化；再进行方差同质性检验，若方差齐则接受方差结果并用LSD法进行两两比较，若方差不齐，则用Tamhane法进行两两比较。以P ＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般情况

分组治疗过程中，假手术组大鼠状态良好，生长及摄食无明显异常，毛发光亮整齐，无死亡；模型组大鼠精神萎靡，饮食减少，消瘦，毛发枯槁，且脱毛，期间死亡6只；A组死亡1只；B组死亡2只；C只死亡1只。经检验，各治疗组之间死亡率没有差异（P ＞0.05）。

2.2 造模2月时，各组动物体质量、Hb比较

造模2 月，与假手术组比较，模型组体质量、Tp、Hb 显著降低（P ＜0.05），BUN、Cr 含量显著增高（P ＜0.01）（表1）。

表1 造模2月部分生化结果比较(n=12)

2.3 治疗60天时，各组动物体质量、Hb比较

治疗60天后，与假手术组比较，模型组体质量、Hb显著降低（P=0.000）；与模型组比较，三治疗组体质量均显著增高（P=0.000），C 组Hb 含量显著增高（P=0.000）；与C 组比较，A、B 组Hb 显著降低（P=0.010,0.024）（表2）。

表2 治疗后各组生化与Hb比较

2.4 各组动物血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比较

与假手术组比较，模型组BUN、Cr、24 h 尿蛋白含量显著增高（P=0.000）；与模型组比较，三治疗组BUN、Cr、24 h尿蛋白含量均显著降低（P=0.000）（表2）。

2.5 治疗60天时，各组肾组织Masson染色比较

经方差检验，各组Masson染色结果之间有显著性差异（F=160.304，P=0.000）。与假手术组比较，模型组胶原含量显著增高（P=0.000）；与模型组比较，三治疗组胶原含量均显著降低（P=0.000）；与C 组比较，A组胶原含量显著增高（P=0.011），B 组与之没有差异（P=0.916）（图1，表3）。

2.6 各组动物Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表达比较

方差齐性检验显示，Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA 表达量的Lenvene 值分别为11.143，4.685，6.339，2.975，2.780（P 值分别为0.000，0.002，0.000，0.026，0.034），说明方差不齐。与假手术组比较，模型组Wnt2、GSK-3β、β-Catenin。与、LN、Col1a1 mRNA表达均显著增高（P=0.000）；与模型组比较，各治疗组Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表达均显著降低（P=0.000）；A、B 组与C 组LN、Col1a1 mRNA表达没有差异（P ＞0.05）（表3，图2）。

表3 各组肾组织GSK-3β、Wnt2、β-catenin、LN、Col1a1 mRNA表达比较(±sd)

表3 各组肾组织GSK-3β、Wnt2、β-catenin、LN、Col1a1 mRNA表达比较(±sd)

与Sham组比较，*P ＜0.05,**P ＜0.01；与model比较，#P ＜0.05,##P ＜0.01；与C组比较，■P ＜0.05

Group n Masson染色Wnt2 GSK-3β β-catenin LN Col1a1 Sham 12 0.967±0.093 1.466±0.161 0.416±0.062 0.416±0.057 1.272±0.368 1.352±0.405 Model 11 8.560±1.359**2.505±0.597**0.784±0.062**0.828±0.067**2.726±0.662**2.393±0.672**A 15 3.143±0.977##■0.462±0.104##■0.510±0.064##0.517±0.064##1.501±0.343##1.616±0.434##B 15 2.335±0.617##0.611±0.116##0.322±0.070##0.378±0.058##1.471±0.354##1.540±0.402##C 16 2.086±0.473##1.100±0.200##0.394±0.101##0.408±0.072##1.432±0.351##1.451±0.291##F(P)160.304(.000)186.555(.000)91.809(.000)59.665(0.000)23.118(0.000)10.387(0.000)

图2 各组肾组织GSK-3β、Wnt2、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表达比较

表4 各组肾组织LN、Col1表达比较(IHC)(±sd)

表4 各组肾组织LN、Col1表达比较(IHC)(±sd)

与Sham组比较，*P ＜0.05,**P ＜0.01；与model比较，#P ＜0.05,##P ＜0.01；与C组比较，■P ＜0.05

Group n LN Col1 β-Catenin Sham 12 0.642±0.327 0.811±0.268 0.968±0.430 Model 11 1.302±0.396**1.441±0.397*8.332±1.441**A 15 1.020±0.210#1.075±0.218■5.814±0.915##■B 15 0.951±0.259##0.943±0.211 4.143±1.071##C 16 0.928±0.237##0.844±0.202#3.728±0.871##F(P)10.121(0.000)9.569(0.000)32.257(0.000)

2.7 各组动物肾组织Col1、LN、β-Catenin 表达比较（IHC）

方差齐性检验显示，肾组织LN、COL1、β-Catenin ，表达量的Lenvene 值分别为0.373、0.000、0.000（表4，图3-5）。与假手术组比较，模型组LN、COL1、β-Catenin，表达均显著增高（P=0.001，0.042、0.000）；与模型组比较，C 组COL1 表达显著降低（P=0.047），A、B、C 三组LN、β-Catenin，表达均显著降低（P=0.013，0.002，0.001，0.005，0.003，0.000）。

图3 各组肾组织Col1表达比较（IHC）（460倍）

图4 各组肾组织LN表达比较（IHC）（400倍）

3 讨论

中药归经理论是以脏腑经络理论为基础，是中药药理理论的一个重要组成部分。归经理论的论述可以溯至《黄帝内经》之《素问·至真要大论》“夫五味入胃，各归所喜，故酸入肝，苦先入心……”，表明味对机体不同部位有选择性，即某种味主要入（或走或行）某一脏腑；《名医别录》最早指出药物入某脏腑的性能，如韭归心，蒜归脾肾等；张仲景在《伤寒杂病论》中论述了部分药物对人体脏腑经络某部位的特殊作用和适应范围；金元时期形成了比较系统的药物归经理论，张元素在《珍珠囊》中首次记录部分药物属于“某行经药”或“某经药”，正式提出归经学说，并倡导分经分部位用药，李东恒、王好古均对归经的内容进行了充实和完善，李东恒列出了十二经脉专药，《汤液本草》专门记录了80余种入、走、到经的药物。“业医不知脏腑，则病源莫辨，用药无方”。归经将脏腑辨证中的病证与药物作用于人体的部位联系起来，而药物的作用部位取决于病的定位，因此中药归经与病的定位有密不可分的联系。“疾病归经”是指在辨证基础上辨明病位，为选择相应归经的药物指示方向[5]。

图5 各组肾组织β-Catenin表达比较（IHC）（与HC比较）

对《中医内科学》中五脏疾病遣方用药归经的统计表明，疾病的五脏定位与所用药物的归经趋向一致，如治疗心系疾病的药物多数归心经（175味，占治疗心系疾病全部药物归经38%，最多）；治疗肺系疾病的药物多数归肺经（216 味，占44%，最多）；治疗肝系疾病的药物多数归肝经（192 味，占29%，最多）；治疗脾系疾病的药物多数归脾经（121 味，占37%，最多）；治疗肾系疾病的药物归心经药（175 味，占30%，最多），归肾经药37 味，占10%，交其他系疾病归肾经药物占比增加1 倍。这些经方（或验方）中的药物归经有主有次，一方面说明方中药物使用有明确的目的，主要针对病变部位用药；另一方面人体内各脏腑之间的关联性（整体观及五行传变）[6]。《中医内科学》中肢体经络疾病并未纳入五脏分类，治疗肢体经络病的药物归经统计显示以归肝经者最多，说明肢体经络病证归结于肝经[7]，据此，潘静等[8]以当归拈痛汤为验方，调整其中归肝经药物的含量（由6.7%调整至46.7%），而调整后的当归拈痛汤对急性痛风性关节炎患者在降低血尿酸水平和缓解急性期症状上明显优于原方（P ＜0.05）。本研究亦是在此理论指导下，组成的归经方，归肾经药物比例从13.5%提高至34.1%。

Wnt/β-Catenin 信号通路在生物进化过程中的一条极为保守而又繁杂的信号通路，参与调控细胞的迁移、增殖、分化、凋亡、上皮间质转化等过程，在肾脏，该信号途径参与肾脏的发育，以及多囊肾、糖尿病肾病、急性肾损伤、肾肿瘤等多种疾病的发病过程。正常情况下Wnt 信号静默，胞质中仅有少量β-Catenin 游离，绝大多数β-Catenin 与E-cadherin 形成复合体；而由GSK-3β；、Axin（骨架蛋白）和APC（结直肠腺瘤性息肉基因产物）组成的降解复合物促使游离的β-Catenin被蛋白酶降解，从而维持胞内β-Catenin的低水平。Wnt/β-Catenin 信号通路在肾纤维化进程中的地位已经得到肾病学者的认同[9-11]，Wnt蛋白通过激活下游的各种因子，促进β-Catenin 在胞质及胞核中过度聚集，促进目的基因转录表达，生成各种相关炎症介质及致纤维化因子，最后导致肾细胞增生、转分化，形成肾脏纤维化[12]。LN是种大分子多功能糖蛋白，可识别细胞表面受体是基膜与细胞紧密结合，是基膜的主要成分，对基膜的构建和稳定有重要作用[13]。

本研究显示，三治疗组均能降低β-Catenin 的聚集和表达，降低COL1的基因表达，层粘连蛋白表达均显著降低，而归肾经组胶原蛋白表达显著降低，其他两治疗组没有显著性差异（与模型组比较），推测三治疗组均能通过Wnt/β-Catenin 号途径改善模型动物纤维化状态，归肾经组在改善贫血状态、降低肾组织胶原蛋白表达上更明显，但三治疗组之间Wnt 经典信号通路的主要蛋白β-Catenin等基因的表达上没有差异，其调节机制还需要进一步研究。