基于亚铁离子催化分光光度法测定葡萄糖

马业菲，付小芬，于丽平，何 文，高 燕，褚然然

(齐鲁理工学院,山东 济南 250200)

葡萄糖是人体内不可缺少的一种物质，直接影响人体内的新陈代谢。近年来，糖尿病的发病率在全球一直呈现上升状态。糖尿病已经成为威胁人类健康的一种疾病。

因此，对于糖尿病患者来说早诊断、早治疗是十分重要的，实时快速监测糖尿病人血液中葡萄糖的含量对控制病情具有非常重要的意义。近年来，文献报道了很多检测葡萄糖的新方法，如荧光法[1]，电化学法[2]，色谱法[3]，等。荧光法具有灵敏度高、检出线低等优点，但成本高、应用范围小；电化学法具有灵敏度高、准确度高等优点，但选择性差；色谱法具有分离效率高、选择性好、检测灵敏度高等优点，但分析成本高。所以发展一种较为简便的葡萄糖检测新方法具有十分重要的意义。

分光光度法由于简单、快速、无需昂贵的分析仪器、可进行可视化检测等优势而备受青睐。但多数依赖于金纳米粒子[4]、氧化铈纳米粒子[5]，纳米粒子合成过程比较复杂，且一般需要进行水溶性处理，操作复杂。因此，建立了一种简便、快速的分光光度法法对葡萄糖的检测是非常有必要的。该研究以Fe(II)来催化H2O2氧化底物TMB发生显色反应。有效的避免了其他纳米粒子的缺陷，具有成本低、操作方便、快速等优点。本研究基于Fe(II)增强了H2O2-TMB反应，建立了一种新的分光光度法并用于葡萄糖的检测。

1 试剂和试剂

1.1 试剂

3,3',5,5'-四甲基联苯胺，氯化亚铁，葡萄糖，葡萄糖氧化酶，果糖，乳糖，麦芽糖，糖尿病病人的尿液(液)，过氧化氢，三羟甲基氨基甲烷，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，盐酸。

1.2 仪器

UV-752N型紫外可见分光光度计、UV-1750型紫外可见分光光度计、恒温水浴锅。

2 实验方法

(1)将不同浓度的葡萄糖溶液加入2.0mL离心管中，加入适量的磷酸缓冲溶液(pH值=7.0)，再加入GOD 25μL(终浓度为10-3g/mL)。将水浴锅逐渐升温到37℃后把混合液放入水浴锅中反应30 min。

(2)加入30μL TMB(终浓度为2.0×10-3mol/L)、1240μL Tris-HCl缓冲溶液(pH值=5.5)和30μL Fe(II)溶液(终浓度为2.0×10-4mol/L)于上述反应液中在2.0mL离心管中混合反应，溶液的终体积为1.5mL。反应5min后测定体系中葡萄糖的含量。

(3)特异性测定实验中果糖、乳糖、麦芽糖(终浓度均为8.0×10-3mol/L)代替葡萄糖。

(4)实际样品中糖尿病患者的尿液50μL代替葡萄糖。

3 结果与讨论

3.1 实验原理

图1 葡萄糖检测反应原理图

如图1所示，在催化剂Fe(II)的作用下，H2O2产生羟基自由基，进而快速的将TMB氧化成oxTMB并且发生明显的颜色变化，且GOD分解葡萄糖产生H2O2。体系在650 nm处的吸光度与葡萄糖的浓度在一定的范围内呈正比。因此，我们可以根据吸光度的变化对葡萄糖进行分析与检测。

3.2 可行性验证

为了验证本实验方法的可行性，我们对Fe(II)催化H2O2氧化TMB的催化活性进行探究。如图2A所示，将不同浓度的Fe(II)加入到含有TMB和H2O2的溶液中，观察到随着Fe(II)浓度的增加，颜色越来越深，并且650nm处的吸光度也不断升高。

该体系利用GOD氧化葡萄糖而产生的H2O2进行实验，为了保证实验的可行性，需要进一步验证。如图2B所示，在不含葡萄糖的条件下，无H2O2的生成，测定的吸光度很小。在含有GOD和Fe(II)的条件下，加入不同浓度的葡萄糖溶液，可以观察到随着葡萄糖含量的增加，吸光度越来越大。结果表明，该方法可以用于葡萄糖的检测。

图2 不同条件下样品溶液的吸收光谱图

3.3 实验条件的优化

为了提高实验的准确性及灵敏度，本实验对影响葡萄糖测定的主要因素：pH值、温度、浓度、时间等实验条件进行了优化。

在固定Fe(II)、H2O2和TMB的浓度下，考察了不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液对信噪比的影响。结果表明pH值=5.5的Tris-HCl缓冲溶液信噪比最大。

在固定H2O2和TMB的浓度下，我们设置一系列不同浓度梯度的Fe(II)溶液去催化TMB发生显色反应。通过实验结果，将2.0×10-4mol/L定为Fe(II)溶液的最佳浓度。

在固定Fe(II)和TMB的浓度下，探究不同浓度的H2O2对吸光度的影响。结果表明，当浓度达到5.0×10-4mol/L时，吸收峰的峰值基本不再发生变化，因此我们把5.0×10-4mol/L作为H2O2的最佳浓度。

在固定Fe(II)、H2O2和TMB的浓度下对时间和温度进行了探究。通过实验结果，我们选取最优分解时间为30min，最适的反应温度为37℃。

3.4 葡萄糖标准曲线的绘制

图3 葡萄糖在650nm处标准曲线

在最优实验条件下建立了基于Fe(II)催化的葡萄糖检测新方法，实现了对于葡萄糖含量的定量检测。650nm处的吸光度值与葡萄糖浓度在2.0×10-3～1.0×10-2mol/L范围内存在良好的线性关系(图3)，线性方程为：I = 0.1064C + 0.2248(其中I代表溶液的吸光度值，C代表葡萄糖的浓度(单位为10-3 mol/L))，相关系数为R2= 0.9983。

3.5 特异性分析

在本实验中，我们为了验证葡萄糖比色检测方法的可靠性，选择了葡萄糖类似物果糖、乳糖、麦芽糖来作为干扰对象进行分析检测。结果表明葡萄糖有明显的信号反应，在650nm处吸光度比较大，而其他糖类基本没有信号反应，吸光度值很小。因此，说明了其他糖类对葡萄糖的选择性测定没有影响。

3.6 实际样品的测定

为了验证基于Fe(II)葡萄糖检测新方法的实用性，本实验选取尿液作为实际样品，用于检测尿液中葡萄糖的含量。正常人的尿液650nm吸光度值很小，随着加入糖尿病患者尿液体积的增加，吸光度越来越大。该检测结果表明此方法适用于检测糖尿病病人中尿液的葡萄糖含量，对于其它实际样品也有一定的实用性，是一种能有效检测葡萄糖含量的新方法。

4 结论

本研究利用Fe(II)催化TMB-H2O2体系建立了一种简洁、快速的分光光度法并用于葡萄糖的检测。该方法具有一些优点：不需要任何化学修饰和合成，成本较低。整个检测过程都在均相溶液中进行，非常方便。将此方法用于实际样品尿液的测定，由检测结果可知，该方法可行性高，结果可靠。因此，本文所构建的分光光度法为检测葡萄糖含量提供了一种新途径。