miR-34a在乳腺癌中的表达及其临床病理学意义

岳会珠 王桂菊 齐红双 许 丽

乳腺癌是1类具有较强家族遗传性的恶性肿瘤，近年来发病率处于高位，最新的生物分子学研究[1]发现血清分子标记物对乳腺癌的诊断、治疗和预后等多方面都可发挥显著的作用。

微小RNA(Minimal RNA，miRNA)是1种非编码单链小分子RNA，对某些mRNA具有特异性识别功能，转录后对mRNA的翻译过程产生抑制，进而调控某些靶基因，发挥调节细胞生长、分化和凋亡等多种生命活动过程的作用。研究[2]证实miRNA的表达失调或功能失调在多种疾病特别是肿瘤的发生发展过程均发挥着重要作用，其根据肿瘤的具体发病部位而发挥调节致癌或抑癌基因的作用。miR-34a是1类具有高度保守的miRNA，在多种恶性肿瘤组织存在低表达量，被认为是具有重要潜力的血清分子标记物，但关于乳腺癌的研究较少[3]。因而，本研究深入探讨了外周血中miR-34a在乳腺癌组织中的表达及其临床病理学意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院病理科收集的乳腺癌组织标本80例(癌组织)、40例癌旁组织标本(癌旁组织)，收集时间2010年1月至2014年10月。乳腺癌患者年龄35～62岁，平均(53.4±8.8)岁，病灶最大径≥3 cm 45例、<3 cm 35例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期26例、Ⅲ期34例；肿瘤类型：浸润性导管癌23例、非浸润性导管癌57例。癌旁组患者，年龄37～64岁，平均(52.0±9.3)岁，两组研究对象的年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入排除标准

1.2.1 纳入标准[4]①乳腺癌的诊断标准参考人民卫生出版社《外科学》第八版中的标准；②患者年龄19～65岁；③标本均来源于手术后切除标本；④患者手术前无放化疗史、免疫治疗史；⑤本研究获得医学伦理委员会的批准。

1.2.2 排除标准 ①转移性乳腺癌；②术后复发患者；③具有放化疗病史；④未经病理学证实。

1.3 RT-PCR法

应用RT-PCR技术检测两组标本中的miR-34a表达水平，具体方法如下：Trizol法提取乳腺癌组织和癌旁组织总RNA，反转录法对提取的总RNA进行反转录并合成cDNA，试剂盒购于美国R&D公司，具体操作按照试剂盒说明书进行。SYBR Green法进行RT-PCR检测，反应条件为15 s预变性，95 ℃；30 s 60 ℃；10 s 72 ℃，反应共40个循环并设3复孔对照[5]。

1.4 原位杂交方法技术

利用本室构建NOEY2真核表达质料NOYE-CR为模板，酶切后体外转录制备RNA探针，长约750 bp；NOEY2正义探针为阴性对照，GAPDH探针检测相同组织为阳性对照[6]。

原位杂交后评分标准：根据着色强度：0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为褐色、黑色。当评分<2分定义为miR-34a低表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组标本中的miR-34a表达水平比较

乳腺癌组织中的miR-34a表达水平显著的低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组标本中的miR-34a表达水平比较

2.2 乳腺癌标本中的miR-34a表达水平与其临床病理学特征的关系

乳腺癌组织中的miR-34a表达水平与肿瘤TNM分期、浸润深度、淋巴结转移具有显著的相关性(P<0.05)；乳腺癌组织中的miR-34a表达水平与患者年龄、肿瘤直径、分化程度、肿瘤类型、ER表达、PR表达无显著关系(P>0.05)，见表2。

表2 miR-34a表达水平与乳腺癌临床病理学特征的关系(例，%)

2.3 乳腺癌中miR-34a表达与其预后的关系

低表达miR-34a乳腺癌患者随访60个月生存21例(46.67%)、失访3例，高表达miR-34a乳腺癌患者生存20例(64.52%)、失访1例，两组生存率比较差异无统计学意义(χ2=2.354，P=0.125>0.05)。

低表达miR-34a乳腺癌患者生存时间短于高表达miR-34a乳腺癌患者[Log Rank(Mantel-Cox) =3.928，P=0.047<0.05)](图1)。

图1 乳腺癌中miR-34a表达与患者预后的关系

3 讨论

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%[7]。流行病学研究[8]统计，乳腺癌已经成为女性健康问题的第一大危害，特别是城市白领，是这一疾病的高危人群。乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究[9]发现乳腺癌的发病存在一定的规律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。目前，化疗药物的治疗和乳腺切除术是治疗乳腺癌晚期的重要手段，其中化疗是针对浸润扩散型乳腺癌的治疗最佳方法，但会诱发肾功能损伤、胃肠道反应和神经毒性等严重不良反应[10]。故而，探寻预估患者的化疗疗效和预后已成为临床研究的重要方向。

miRNA是最近几年发现的可调控肿瘤发生、发展过程的小分子RNA，对某些基因的位点可发挥靶向作用进而抑制肿瘤RNA的翻译过程，研究[11]也证实乳腺癌与miRNA的迁移过程和病理发展过程关系密切，利用miRNA芯片技术检测乳腺癌组织中的miRNA的表达情况，并与正常乳腺组织进行对比发现乳腺癌组织中存在多种miRNA的异常表达，其中miR-155、miR-29c、miR-365等均出现过表达情况，但miR-31、miR-127和miR-497均存在弱表达，该结果也提示我们不同的miRNA在乳腺癌的表达情况和发挥的作用也不尽相同。miR-34a是最近发现的一类miRNA，其在多类肿瘤中均存在表达水平的显著下降并认为miR-34a可能具有抑制癌基因的重要保护功能，但现阶段关于乳腺癌和miR-34a的研究较少。因而，本研究深入探讨了外周血中miR-34a在乳腺癌组织中的表达及其临床病理学意义。

本研究结果显示乳腺癌组织中的miR-34a表达水平显著的低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果说明miR-34a可能参与了乳腺癌的发生、发展过程，进而发挥抑制癌基因的作用。乳腺癌标本中的miR-34a表达水平与患者临床病理学特征的关系结果显示乳腺癌组织中的miR-34a表达水平与患者的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移具有显著的相关性(P<0.05)。该结果说明mir-30a具有抑制乳腺癌肿瘤转移和生长的作用。miRNAs主要通过抑制靶基因的特殊位点降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻译，进而对靶基因负性调控，发挥肿瘤转移和生长的作用[12]。

乳腺癌组织中的miR-34a表达水平与患者的年龄、肿瘤直径、分化程度、肿瘤类型、ER表达、PR表达的情况无显著关系(P>0.05)；低表达miR-34a乳腺癌患者随访60个月生存21例(46.67%)、失访3例，高表达miR-34a乳腺癌患者生存20例(64.52%)、失访1例，两组生存率比较差异无统计学意义(P=0.125>0.05)。但低表达miR-34a乳腺癌患者生存时间低于高表达miR-34a乳腺癌患者(P=0.047<0.05)。上述结果说明miR-30a的表达异常可作为乳腺癌预后情况的独立预测指标，并预测miR-34a可称为乳腺癌治疗的治疗靶点之一。

现阶段关于miR-30a在肿瘤组织的具体作用机制尚未得到完全解释，张展[13]通过研究〗发现miR-30a可靶向整合抑制乳腺癌细胞的MDA-MB-435s和MCF-7的体外迁移、黏附和侵袭；程孟文[14]研究显示miR-30a可作为作为细胞自噬抑制剂而抑制ATG5和BECN1的表达情况促进化疗引发的细胞毒性应答作用。上述的研究均证实miR-30具有成为抑癌基因的潜力，并可成为1类特异性标志物对肿瘤的侵袭潜能和转移状态进行准确反映，但关于miR-30a基因关于乳腺癌发展机制的研究和与是否具有与其他基因相互作用还需进一步研究探讨。

综上所述，乳腺癌组织中miR-34a低表达，并且与患者TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、不良预后有关。