Vimentin及E-钙黏蛋白在早期乳腺癌诊断中的应用价值

郝文涛 张海雁

乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的1种，占30%[1]。近年来一些研究发现上皮-间质转化(EMT)与多种肿瘤的发生有关联，包括卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等[2]，这种表达性的转化使肿瘤细胞摆脱了细胞间的粘附，易于离散，更具有侵袭力，上皮性标志蛋白Vimentin和E-钙黏蛋白被认为是EMT发生的重要标志[3]。因此，本研究拟探讨通过检测Vimentin和E-钙黏蛋白来早期检测乳腺癌的可行性及应用价值。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 资料

收集2013年4月至2017年4月来我院就诊的早期乳腺癌患者60例，均经触诊、B超检查及钼靶检查确诊，并经病例确诊为早期乳腺癌。经确诊为TNMⅠ期乳腺癌35例，Ⅱa期乳腺癌25例，年龄26～65岁，平均年龄(48.32±12.42)岁；按部位：外上象限27例，外下象限15例，内上象限10例，内下象限8例；病理分型：浸润性导管癌30例，粘液癌8例，导管内癌18例，低分化癌2例，乳腺分泌型癌1例，髓样癌1例；选择同期门诊就诊的良性乳腺疾病患者60例，作为良性对照组；良性乳腺疾病包括：急性乳腺炎20例，乳腺囊肿14例，单纯性乳腺增生12例，囊性乳腺增生10例，其他4例。所有患者均知情同意，并签署知情同意书。本试验已通过本院医学伦理委员会审查。

1.2 纳入标准

①所有患者均为18～70岁；②均为首发乳腺癌患者，无其他恶性肿瘤；③均经触诊、B超检查及钼靶检查确诊，并经病例确诊为早期乳腺癌；④无其他免疫系统疾病；⑤无严重的心脑肾疾病及多器官衰竭。⑥均自愿参加本次研究，且签署知情同意书。

1.3 检测仪器及方法

1.3.1 样本采集 各组患者均在入院时采集外周血5 ml，4 ℃、3 000 r/min离心5 min后取血清，保存在-80 ℃超低温冰箱中，等待检测。

1.3.2 主要试剂 鼠抗人E钙黏蛋白单克隆抗体1.5 ml购置于北京中衫生物工程公司；Vimentin鼠抗猪单克隆抗体1.5 ml购置于福州迈新生物技术公司。二抗试剂：二步法兔/鼠通用免疫组化试剂盒(100 ml，Dako real EnVision，HRP rabbit/mouse)试剂均保存于4 ℃冰箱保存，使用前按抗体说明书稀释。

1.3.3 方法 免疫组织化学染色步骤：①将病理蜡块连续切成4 μm均匀厚度的切片，置于60 ℃的烤箱中烤30 min后依次放入二甲苯及梯度乙醇中脱蜡；②将切片置于4 ℃冷藏后的枸橼酸盐缓冲液中，微波修复后自然冷却；③滴加一抗，室温孵育4 h；④滴加二抗，室温孵育30 min；⑤滴加新鲜配置的DAB显色剂于切片上，显色1～3 min后自来水冲洗中指显色；⑥苏木精复染3 min，脱水后中性树胶封片。

1.3.4 结果判定 采用双盲法对结果进行判定E钙黏蛋白为细胞质细胞膜染色，在光镜下可见细胞质、细胞膜中均有阳性反应细胞，E钙黏蛋白阳性染色呈棕黄色连续线装；Vimentin阳性染色主要定位于胞质，呈棕黄色颗粒状。分别在5个不同高倍视野相同范围下计数500个细胞及免疫组化阳性细胞数。结果：①阳性细胞率<5%为(-)；②：阳性细胞率在5%～50%之间为(+)；③阳性细胞率在50%～75%为(++)，④阳性细胞率>75%为(+++)。检测结果为(+)、(++)、(+++)则为阳性，(-)为阴性。

1.4 统计学分析

应用SPSS 17统计软件对数据进行分析处理，计量资料采用均数±标准差进行描述，计数资料采用频数或率进行描述，计数资料的比较采用卡方检验。乳腺癌组织中Vimentin与E-钙黏蛋白表达的相关性分析采用McNemar分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Vimentin在组织中的表达

由表1可见，早期乳腺癌组患者Vimentin的表达阳性率高于良性对照组，差异具有统计学意义(χ2=62.48，P=0.000)。

表1 两组患者Vimentin表达情况(例，%)

2.2 E-钙黏蛋白在组织中的表达

由表2可见，早期乳腺癌患者E-钙黏蛋白的表达阳性率低于良性对照组，差异具有统计学意义(χ2=25.49，P=0.000)。

表2 两组E-钙黏蛋白表达情况(例，%)

2.3 乳腺癌组织中Vimentin与E-钙黏蛋白表达检测结果分析

由表3可见，乳腺癌患者Vimentin检测阳性率较高，而E-钙黏蛋白在乳腺癌患者中检测阳性率较低，差异具有统计学意义(χ2=21.55，P=0.000)。

表3 Vimentin与E-钙黏蛋白表达检测结果分析/例

3 讨论

乳腺癌是当今世界威胁女性健康的第一杀手，女性发病率远远高于男性。全球每年约有120万患者检测出罹患乳腺癌，给女性的身体和心理造成了永久性的伤害，甚至危害女性的生命安全。但乳腺癌起病隐匿，缺乏早期的典型症状，很多患者一经发现已经到了进展期或晚期，65%的患者在查出乳腺癌的时候已经发生了转移，即使做了根治性手术[4]，由于肿瘤组织增生能力强、无限增殖，并具有强大的侵袭力，也很难从根本上治愈，给预后带来隐患。因此，我们需要找到一些特定的标志物，能够帮助临床医生准确的判断，识别乳腺癌，才能在临床上真正做到“早发现，早诊断，早治疗”。

上皮-间质转化是指上皮通过一系列的变化获得了间充质细胞的表型。而在这一变化的过程中细胞发生了极大程度的变化，包括细胞极性消失，细胞骨架重塑、细胞粘附力下降，并且获得了侵袭、抗凋亡等生物学特性[5]。整个Emt过程的发展由多种生长因子及多条信号通路转导信号共同调节。E-钙黏蛋白便是Snai/E-cadherin信号通路上1种钙依赖性细胞粘附分子[6]。该蛋白如果不能抑制下游调控分子，则会导致细胞粘附力降低，使肿瘤细胞更容易转移到远隔部位。目前已有研究表明，E-钙黏蛋白的表达水平下降与多种肿瘤相关，包括胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、贲门癌、卵巢癌等[7-9]。在本次研究中，我们同时检测了良性乳腺疾病患者于早期乳腺癌患者组织中E-钙黏蛋白的表达，结果发现早期乳腺癌患者组织中E-钙黏蛋白的阳性表达率低于良性乳腺疾病患者，且差异具有统计学意义(P<0.05).这一研究结果与邓淼等[10]的研究一致。马怡晖等[11]也在研究中发现，乳腺癌患者组织中E-钙黏蛋白的表达水平低于正常组织，且差异具有统计学意义(P<0.06)。这一结果提示我们E-钙黏蛋白的产生可能是肿瘤发生和发展道路上必经的一步，通过调控多种信号通路使上皮细胞发生EMT过程，从而增加了肿瘤组织的侵袭力。

Vimentin也EMT过程中的1种上调标志物蛋白，目前已经有很多报道研究表明Vimentin的表达增高与前列腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌等有密切关系。本研究发现在早期乳腺癌患者中Vimentin检测阳性率高于良性乳腺癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。李裕明等[12]在一项原发性肝癌的研究中发现，E-钙黏蛋白的表达与Vimentin的表达呈负相关，猜测可能是Vimentin的表达增加了癌细胞迁移和侵袭能力，而这是通过降低E-钙黏蛋白的表达而实现的。周杰等[13]在颅咽管瘤中也发现了E-钙黏蛋白的表达与Vimentin的表达呈负相关。

综上所述，本研究结果提示，Vimentin与E-钙黏蛋白均与乳腺癌存在密切关系，对乳腺癌早期诊断具有一定指示作用。同时，应该更加深入研究乳腺癌EMT发生机制，为乳腺癌的分子治疗提供更有力的临床依据。