DNA 条形码技术在淀粉掺假鉴别中的应用

陈 佳，王 爽，周 巍，张 岩,*，桑亚新,*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.山东省标准化研究院，山东 济南 250000；3.河北省食品检验研究院 河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050071）

淀粉是现代食品加工业中一种重要的生产原料，也可以作为一种重要的工业原料用于胶黏、填充等途径中[1]。目前常见的淀粉种类有马铃薯淀粉、番薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、麦类淀粉等。其超微形态、糊化温度等理化性质存在一定的差异，原材料成本及加工工艺的不同也造成了价格大有差别[2-5]。随着淀粉加工、深加工产品的丰富，淀粉伪造或掺假问题日益突出。目前市场上发现的掺假淀粉总体分为两类，一类是在淀粉及淀粉制品中掺入滑石粉、白陶土、非食用色素等杂质以次充好，一类是掺入价格较低廉的植物淀粉投机销售，如在马铃薯淀粉中掺入玉米[6]、苜蓿、荞麦等。虽然后者的掺假现象等不会对人体健康造成严重影响，但理化性质的差异会影响食品的成色、品质，并且冒充高价格的淀粉销往市场谋取非法利润，严重扰乱市场秩序，对合法生产者和消费者来说都是一种损害。

因此，加强对淀粉及其制品的鉴别检验极为重要。淀粉的检测主要由感官指标、理化指标和卫生指标3 项综合指标组成[1]。感官检测方法简单但检测结果仅能作为辅助参考。理化检测耗时费力，并且对于第2类掺假问题难以准确鉴别。目前对淀粉掺假研究的检测方法有扫描电镜、稳定碳同位素比质谱技术[7]、碘试剂显色反应等。准确判定淀粉掺假，确保食品标签制度的有效实施，需要灵敏、可靠的检测方法鉴定植物源食品的物种来源。

DNA条形码技术基本原理是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在种内的特异性和种间多样性，实现对物种的快速自动鉴定[8-10]。目前该技术在植物领域的研究和应用稍落后于动物类群的研究[11-17]，植物DNA条形码的选择及评价缺乏统一的标准。目前植物领域DNA条形码候选片段主要集中于叶绿体和核糖体中，主要包括成熟酶K蛋白（maturase K protein，matK）、质体trnH-psbA间隔区、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，rbcL）、核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）等其他单片段[9,18-19]。但大量研究结果表明，单一片段的植物DNA条形码存在一定局限性而分辨率较低，因此有研究[20-21]提出植物条形码片段组合理念，利用优势互补提高植物种类的鉴定识别率。研究表明陆地植物中较为可行的组合是rbcL（科级）＋matK（属级）＋ITS和trnH-psbA（种级）[8]。目前国内对于DNA条形码技术的研究重要集中在单一科属动植物的分类鉴定[22-23]，对于食品掺假鉴定的相关文献较少[24-25]，尤其是植物性食品掺假鉴定方面鲜有报道。

本研究使用ITS2、rbcL、matK、trnH-psbA序列的通用引物对苜蓿、马铃薯、木薯、番薯、玉米5大淀粉原物种进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和测序比对，比较各序列的扩增效率和测序成功率，评价不同DNA条形码候选序列对淀粉原物种的鉴别能力，筛选出较适合的DNA条形码组合，并对市售淀粉及粉条制品进行物种鉴定和掺假判定，为植物DNA条形码技术在植物源食品的检测技术提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究用样本主要选择淀粉加工类品种，苜蓿（青海苜蓿、本草苜蓿）、马铃薯（系薯1号、安薯56号、晋薯5号）、木薯（华南7号、华南8号、面包木薯）、番薯（商薯9号、漯薯10号、徐薯32号、渝薯17号）、玉米（良玉99、登海6702、中单909）由河北农业大学提供，待测样本5 种淀粉、4 种粉条制品均为市购。

植物基因组DNA提取试剂盒、PremixTaq、Marker（1 000 bp） 宝生物工程（大连）有限公司；GelRed、琼脂糖 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LX-100手掌型离心机 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DYY-III2稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂；BS-124S分析天平 北京赛马利斯公司；紫外凝胶成像系统、S1000 thermal cycler基因扩增仪 美国伯乐公司；1-15pk冷冻离心机 德国Sigma公司；NanoDrop 1000微量核算蛋白测定仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

阳性样本及待测样本基因组DNA提取均采用植物基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用手说明书进行基因组DNA提取。

1.3.2 PCR扩增

PCR扩增所用通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

PCR体系（50 μL）：模板DNA 5 μL；PremixTaq25 μL；正向引物（10 μmol/L）2 μL；反向引物（10 μmol/L）2 μL；无菌水定容到50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，54～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，反应36 个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，使用凝胶成像系统分析扩增产物。

1.3.3 PCR产物测序及比对

PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，测序引物同于扩增引物。所得的测序结果经拼接并删除两端引物序列，提交GenBank进行BLAST比对。

1.3.4 引物通用性验证

将苜蓿、马铃薯、木薯、番薯、玉米分别按照1.3.1节进行基因组DNA提取，经PCR扩增和产物测序比对后验证选择引物对的通用性。

2 结果与分析

2.1 DNA条形码序列片段的扩增

提取苜蓿、马铃薯、木薯、番薯、玉米5大物种基因组DNA，分别以ITS2、matK、rbcL和trnH-psbA通用引物进行PCR扩增，并以无菌水作为模板进行阴性对照。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。综合分析，ITS2和trnH-psbA扩增效率较高，在阳性样本的苜蓿、马铃薯、木薯、番薯和玉米中均扩增出清晰的条带。ITS2序列扩增条带大小在500 bp左右，其中在马铃薯中还扩增出700 bp左右大小的非特异条带。trnH-psbA在苜蓿、马铃薯、木薯中扩增出600 bp大小的条带，而在番薯和玉米中分别得到300 bp和700 bp大小的条带，扩增条带大小差异显著。matK序列引物的通用性较差，仅在马铃薯和红薯中扩增出条带，其中马铃薯中的条带较弱，扩增效果较差。而rbcL序列通用引物在苜蓿和番薯中呈现清晰单一的扩增条带，在马铃薯扩增结果中有非特异的较大片段，而在木薯中扩增效率较低。

图1 阳性样品4 种基因片段的PCR扩增电泳图Fig. 1 Electrophoresis patterns of 4 genes amplified by PCR frompositive samples

2.2 PCR产物测序成功率

将PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序，测序结果提交GenBank进行BLAST比对分析，结果如表2所示。ITS2基因分别在苜蓿、番薯和玉米样品中比对成功，而在马铃薯样品中比对结果为番茄，且相似率仅为80%，物种特异性较差。matK基因分别在马铃薯和番薯样品中扩增出条带，但在马铃薯样品中扩增条带较弱，比对失败，而在番薯中比对成功，相似率为99%。rbcL基因对马铃薯和番薯的灵敏性较高，而在苜蓿中未得到理想比对结果。trnH-psbA基因的测序成功率较高，在苜蓿、马铃薯、木薯、番薯中均比对成功，但在玉米样品中比对结果为束尾草属植物。

表2 不同DNA序列GenBank数据库比对鉴定结果Table 2 Results of sequencing and identification in alignment with GenBank

为进一步对DNA条形码序列进行评价和筛选，对4 个DNA序列的PCR扩增效率（呈现清晰条带即为判定成功）、测序成功率（测序比对成功）及序列有效获得率（PCR扩增效率×测序成功率）进行统计，统计结果如表3所示。结果显示，ITS2和trnH-psbA的序列有效获得率较高，分别为60%和80%，而matK和rbcL片段的有效率仅为8%和24%。尽管统计样本容量较小，但统计结果仍为淀粉检验DNA条形码的有效选取提供一定的指导和参考。综上分析，ITS2和trnH-psbA基因组合可作为候选基因片段进行后续实验。

表3 不同DNA序列PCR扩增及测序效率Table 3 Results of PCR amplification and sequencing by using different DNA sequences

2.3 引物通用性验证结果

为进一步验证本研究获得的ITS2和trnH-psbA引物组合通用性，对苜蓿（青海苜蓿、本草苜蓿）、马铃薯（系薯1号、安薯56号、晋薯5号）、木薯（华南7号、华南8号、面包木薯）、番薯（商薯9号、漯薯10号、徐薯32号、渝薯17号）、玉米（良玉99、登海6702、中单909）进行DNA条形码的引物验证。由表4可知，苜蓿、番薯、玉米3 个物种的不同品种均能通过ITS2引物扩增并完成比对鉴定，苜蓿、马铃薯、木薯、番薯4 个物种的不同品种均能通过trnH-psbA引物扩增并完成比对鉴定，因此可以说明ITS2和trnH-psbA引物组合的通用性良好。

表4 不同物种GenBank数据库比对鉴定结果Table 4 Results of sequencing and identification of different plant species in alignment with GenBank

2.4 实际样品的DNA鉴定

试剂盒法提取抽检的4 个粉条样品和5 个淀粉样品的基因组DNA，分别利用ITS2基因和trnH-psbA基因引物进行PCR扩增，并以无菌水作DNA模板进行阴性对照[26]，扩增结果如图2所示。阴性对照组无扩增条带，证明PCR体系未污染。粉条和淀粉样品均扩增出400～600 bp大小的条带，且条带清晰未有杂带，扩增效率较高。

图2 待测样品基因片段的PCR扩增电泳图Fig. 2 Electrophoresis profiles of genes amplified by PCR from samples

将上述PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，并将测序结果提交GenBank进行BLAST比对分析，比对结果均为苜蓿属，结果如表5所示。

表5 抽检样品物种鉴定结果Table 5 Species identification of samples

为进一步验证结果的可靠性，根据苜蓿叶绿体间隔区序列（HQ199041.1）设计苜蓿特异性引物Primer-F：5’-GACGTGTTTCGTAAAG-3’，Primer-R：5’-CTCGAAAAAAGCCTTCT-3’，进行PCR扩增验证。如表5所示，5 个淀粉样品和3 个粉条样品测序比对均为苜蓿，粉条4样品因PCR扩增效率低未得到结果。综合分析以上结果，自行购买的粉条和淀粉样品均掺有苜蓿成分，与样品包装标签成分不符，可判定为掺假样品。

3 讨 论

DNA条形码技术是当今生物学研究的热点之一，它操作简单，不受个体发育阶段和形态特征的限制，并可以作为传统分类学的辅助手段，解决物种鉴定分类等难题[9]。理想的DNA条形码应符合一些基本标准：1）具有足够的遗传变异性和一定的分化度；2）标准的DNA片段；3）包含足够的系统进化信息；4）便于通用引物设计；5）目标DNA足够短，便于提取和扩增。虽然DNA条形码的研究仍存在一定的争议，但其在动物分类学中的研究已相对成熟，并选取动物细胞色素C氧化酶I基因（coi）作为动物界标准基因[27]。生命条形码联盟植物工作组决定将叶绿体中的rbcL和matK两个基因片段作为植物DNA条形码核心条码，核基因的ITS片段和叶绿体中的trnH-psbA片段作为补充条码[11]。

本研究结果显示，ITS和trnH-psbA序列有效获得率较高，并筛选出ITS2和trnH-psbA为较适片段组合，这与前人的研究结果一致。Kress等[18]认为多基因片段组合可实现植物类群的条形码鉴定，并提出ITS和trnH-psbA是较好的选择。陈之端等[27]利用rbcL和ITS两个DNA片段对桦木科6 属36 种个体取样分析，建立了桦木科的系统发育，揭示了桦木科属间系统关系。陈士林等[28-29]在药用植物中筛选DNA条形码，发现ITS2在种级水平上的分辨率可以达到92.7%。侯新东等[30]对荨麻科植物DNA条形码筛选的研究中发现，trnH-psbA、ITS2、rbcL和matK序列有效获得率分别为95.4%、92.3%、90.1%和0%，且trnH-psbA、ITS2、rbcL可作为鉴别荨麻科植物的有效DNA组合。

植物性食源物种种类多且复杂，加工工艺的提高使得植物性制品的原料很难通过形态特征等判定。食品加工制造业的不法商家在加工品中掺杂使假、以次充好，以低价原料冒充高价原料加工销售，扰乱公平竞争社会风气，损害消费者和守法生产商的利益。本研究结合ITS2和trnH-psbA组合对抽检的淀粉和粉条制品进行鉴定，经测序比对发现均掺有苜蓿成分。苜蓿与其他植物源材料相比，价格低廉。虽然掺入的苜蓿成分对人体无害，但其与产品标签标注不符，存在商业欺诈行为。植物DNA条形码技术的应用前景广，但需要DNA条形码数据库序列的不断完善，因此目前DNA条形码在产品鉴定中的应用较少。本研究为植物DNA条形码技术的在植物源食品物种鉴定方面的应用提供一定参考。