基于特征肽段的阿胶中异源性物种鉴别

房 芳，张九凯，马雪婷，苏 敏，陈 颖,*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.乌鲁木齐海关，新疆 乌鲁木齐 830063）

阿胶是一种由哺乳纲奇蹄目马科动物驴的皮为主要原料熬制而成的胶类药材[1]，具有补血滋阴、润燥止血、增强人体免疫力等功效[2-4]，与人参、鹿茸并称“中药三宝”[5]。由于驴皮原料不足，价格昂贵，一些不法商人受经济利益驱使，在阿胶生产过程中掺入低价胶类药材，如新阿胶（猪皮源）、黄明胶（牛皮源），非法谋利的情况屡见不鲜[6]，除此以外，使用其他性状相似的哺乳动物皮类（如马皮）投料违法生产的现象也时有发生[7]，致使市场上阿胶药材掺假、掺杂现象严重，市场秩序混乱。

传统的物种鉴别技术主要以酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[8]和以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的核酸检测方法[9-13]为主。基于蛋白水平的ELISA技术操作简单，检测成本低，可同时检测大量样品，但是该方法一次只能检测单个蛋白质，不能同时检测多个物种，反映特异性也不好，假阳性较高[14]。核酸检测方法特异性强、灵敏度高，结果准确，是动物源性产品物种鉴别的主流方法[15-17]，但由于阿胶为深度加工产品，在长时间高温熬煮过程中，DNA破坏严重[18]，限制了核酸技术在阿胶掺假物物种鉴别的应用。阿胶中的主要成分是驴皮胶原蛋白高温不完全水解后的肽段，从分子遗传学角度研究，由于不同物种DNA序列不同，其表达的氨基酸序列必然存在差异，使得不同来源蛋白酶切生成的肽段具有一定的特异性。利用灵敏度高、重复性好的质谱技术对不同物种间特征肽进行分析和测定[19-22]，为阿胶的物种鉴别提供了新的途径。

近年来，以质谱为核心技术的鸟枪蛋白组学方法在物种鉴别领域得到了广泛应用，该技术将蛋白质混合物酶解成肽段混合物，并利用色谱及质谱对具有物种特异性的特征肽段进行分析、鉴定，从而达到物种鉴别的目的[23-26]。与传统方法相比，肽段稳定性更高，受生产加工方式的影响也相对较小。因此，本研究针对阿胶中掺入低价胶类药材，如新阿胶（猪皮胶）、黄明胶（牛皮胶）和近缘胶（马皮胶）的现象，采用鸟枪蛋白组学方法，通过比对驴和猪、牛、马的蛋白酶解后的肽段序列，以期从肽段层面实现阿胶中异源性物种来源的鉴定，并为其他动物源性食品或药材的物种鉴定提供理论指导和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿胶（n=3）、黄明胶（n=3）、新阿胶（n=2）、马皮胶（按药用阿胶工艺制得，n=2）、生驴皮（n=2）、生牛皮（n=2）、生猪皮（n=2）、生马皮（n=2）北京同仁堂公司；阿胶对照药材 中国食品药品检定研究院；96孔板 美国Thermo公司；滤纸 美国Whatman公司。

乙腈（色谱级） 德国CNW公司；甲酸 美国Sigma公司；去离子水 Milli-Q纯水系统；胰蛋白酶美国Thermo Fisher-Pierce公司；尿素（蛋白质组学级）美国Promega公司；硫脲 美国Americo公司；考马斯亮蓝G250 北京克尔慧公司；牛血清蛋白 美国Sigma公司；碳酸氢钠（纯度99%） 中国医药集团。

蛋白质提取液：含有7 mol/mL尿素和2 mol/mL硫脲。称取210.2 g尿素，76.12 g硫脲在常温下用去离子水溶解并定容至500 mL（溶液温度控制在37 ℃以下）。

牛血清蛋白标准溶液：称取0.01 g牛血清蛋白置于10 mL容量瓶中，用 0.15 mol/L NaCl溶液定容至10 mL，室温下充分混合溶解1 h，10 000 r/min离心。

1.2 仪器与设备

LC-20AD XR高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；TripleTOF®5600质谱仪、QTRAP®5500质谱仪美国AB SCIEX公司；Chrom XP Eksigent C18反相色谱柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 nm）、Multiskan GO型酶标仪 美国Thermo Scientific公司；BEH C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm，300 nm） 美国Waters公司；TissueLyser II型组织研磨仪 德国QIAGEN公司；ME403E型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Concentrator plus型真空浓缩仪、Centrifuge 5418R型离心机 德国Eppendorf公司；SB5200D型超声清洗仪宁波新芝生物科技股份有限公司；Vortex-Genie 2型振荡器 美国Scientific Industries公司；HH-1型数显恒温水浴锅 金坛市白塔新宝仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取与含量测定

取约2 g样品制成粉末，称取0.50 g皮胶粉末，加入5 mL蛋白提取液，离心后测定上清液中蛋白含量，取约含200 µg蛋白的上清液并转移到超滤管中，12 000 r/min离心10 min，加入100 µL 50 mmol/mL碳酸氢铵溶液，12 000 r/min离心10 min，重复3 次，加入100 µL含有胰蛋白酶的50 mmol/mL碳酸氢铵溶液振荡混匀，37 ℃酶解4 h（胶原蛋白因不含半胱氨酸而未涉及烷基化处理）。将下层超滤离心管取下放入冷冻干燥机中旋干滤液，加入去离子水，12 000 r/min离心10 min，重复3 次，最后加入100 µL 2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液定容。

Bradford法测定蛋白含量：1）标准曲线配制：分别移取0、20、40、50、60、80、100 µL 1 mg/mL牛血清蛋白标准溶液于1.5 mL EP管中，加入相应体积尿素-硫脲液补足100 µL。配制成标准曲线系列浓度：0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg/mL。2）样品溶液稀释：分别将样品上清液稀释合适倍数，混匀备用。3）分别取各系列浓度溶液及样品稀释液30 µL，加入1 mL考马斯亮蓝染料，混合均匀。4）分别取300 µL系列标准溶液及样品稀释液的混合液加入96 孔板样品孔中，595 nm波长处测定吸光度建立标准曲线，并测定样品，计算相应蛋白含量。

1.3.2 检测条件

1.3.2.1 纳升高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（nano high performance liquid chromatography-quadrupoles time of fl ight-mass spectrometer，Nano-HPLC-QTOF-MS）条件

在线Nano-HPLC条件：色谱柱：Chrom XP Eksigent C18反相色谱柱（75 μm×15 cm，3 μm）；上样流速2 μL/min；时间10 min；柱温40 ℃；流动相A为2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液；流动相B为98%乙腈（含0.1%甲酸）溶液；流速0.3 μL/min；进样体积4 μL；梯度洗脱程序：0～0.1 min，5%～9% B；0.1～30 min，9%～25% B；30～40 min，25%～35% B；40～45 min，35%～80% B；45～50 min，80% B；50～51 min，5% B；51～60 min，5% B。

AB SCIEX Triple TOF®5600 QTOF-MS条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；喷雾电压：2.4 kV；雾化气：41.4 kPa；气帘气：207 kPa；质谱扫描模式：信息依赖型采集工作模式；TOF MS模式：m/z350～1 500，250 ms；IDA TOF MS/MS模式：m/z100～1 500，30 MS/MS，100 ms，IDA阈值：120 cps，母离子电荷选择范围为＋2～＋5；Rolling CE：enabled；动态排除时间：20 s；运行时间：60 min。

1.3.2.2 高效液相色谱和三重四极杆质谱条件

高效液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流动相A为2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，流动相B为98%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，流速0.6 mL/min，柱温40 ℃，进样量：5 µL。梯度洗脱程序：0～0.1 min，2% B；0.1～0.5 min，2%～8% B；0.5～25 min，8%～22% B；25～31 min，22%～35% B；31～33 min，35%～80% B；33～36 min，80% B；36～36.5 min，80%～2% B；36.5～39.9 min，2% B。

AB QTRAP®5500质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描参数：气帘气（CUR）2.76×105Pa，碰撞气（CAD）Medium，IS电压5 500 V，离子源温度600 ℃，雾化器（GAS1）414 kPa，辅助气（GAS2）414 kPa；正离子扫描Scheduled多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式：MRM检测窗口60 s；扫描时间3 s。

1.3.3 特征肽段的检测与验证鉴定

以奇蹄目（Perissodactyla）、偶蹄目（Artiodactyla）为关键词，在Uniprot数据库检索相关蛋白数据库并导入ProteinPilot 5.0软件进行蛋白质的鉴定，参数设定如下：Sample Type：Identification；Cys Alkylation：Iodoacetic acid；Digestion：Trypsin；Search Effort：Rapid ID；ID Focus：Biological modifications；FASTA：Sesamum indicum（Uniprot）。选取响应高、得分＞20、氨基酸个数6～20、可信度＞95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段。

利用Skyline软件构建马皮特征肽MRM离子对，将特征肽段转化为三重四级杆串联质谱能够识别的离子对信息。同时对离子对的碰撞能量和驻留时间进行优化。

2 结果与分析

2.1 阿胶及掺假胶蛋白鉴定

通过Nano-HPLC-QTOF-MS分别对阿胶、新阿胶、黄明胶和马皮胶样品进行鉴定，并采用ProteinPilot软件进行数据处理（表1）。结果显示，阿胶、新阿胶和黄明胶鉴定到丰度最高、有效肽段总数最多的蛋白分别为驴源、猪源、牛源的I型胶原蛋白α1链，而马皮胶丰度最高的蛋白为驴源I型胶原蛋白α1链，说明驴和马的胶原蛋白有很强的亲缘性，此外在马皮胶的鉴定结果中并没有找到与马源I型胶原蛋白α1链具有较高的匹配度的蛋白。I型胶原蛋白是动物源性皮类胶原蛋白重要组成，约占胶原蛋白总量的80%～90%，陆生哺乳动物I型胶原蛋白主要分为α1、α2两种亚型[27]。除胶原蛋白以外，还鉴定到核层蛋白、肌球蛋白、角蛋白、血影蛋白等，仅在阿胶样品中检测到血红蛋白。

表1 高分辨质谱鉴定结果统计Table 1 Results of identi fi cation of donkey-hide gelatin and animal glues by high-resolution mass spectrometry

2.2 不同物种来源胶类特征肽段检测结果

由于阿胶、新阿胶、黄明胶样品溶液鉴定到丰度最高的蛋白分别为驴源、猪源、牛源的I型胶原蛋白α1链，且马皮胶丰度最高的蛋白也为驴源I型胶原蛋白α1链。因此，利用GENtle软件对驴、猪、牛的I型α1胶原蛋白序列进行多序列比对，通过模拟胰蛋白酶酶切分别获得3 种胶原蛋白的理论特征肽段。采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪MRM方法对3 种胶原蛋白的理论特征肽进行了验证，证实了4 条理论特征肽的存在，受试的驴皮胶（含阿胶对照药材）及生驴皮、新阿胶及生猪皮、黄明胶及生牛皮的酶解溶液中均验证到各自物种的特征肽段，而不同物种样品间各特征肽互不检出。马皮胶、生马皮的酶解溶液中验证到驴的特征肽段（表2）。

表2 特异肽段的MRM参数Table 2 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters for specific peptides

2.3 驴、猪和牛来源胶类特征肽段检测结果

图1 3 个物种胶原蛋白COL I型α1序列差异比对Fig. 1 Sequence alignment of collagen I α1 in 3 species

图2 3 个物种胶原蛋白COLI型α1序列三螺旋域与非三螺旋域Fig. 2 Triple helix domain and non-triple helix domain of collagen I α1 sequence in 3 species

3 个物种胶原蛋白C O L I型α1序列差异比对见图1。在证实的4 条特征肽中，阿胶特征肽1066GEAGPAGPAGPIGPVGAR1083、新阿胶特征肽1069GETGPAGPAGPVGPVGAR1086和黄明胶特征肽1066GETGPAGPAGPIGPVGAR1083具有很强的相似性：1）3 条肽段所在序列位置相近，前12 个氨基酸残基位于序列中的非三螺旋结构域，其余6 个则位于最后一段三螺旋结构域的起始位置（图2）；2）3 条肽段均由18 个氨基酸组成，氨基酸排列顺序极为相似，仅有2 处氨基酸残基存在差异；3）序列中氨基酸均未发生修饰。由于三螺旋结构是胶原蛋白的特有结构，胶原蛋白所特有的羟脯氨酸是胶原三螺旋结构形成氢键的必需氨基酸，由此推断，在胶原蛋白非螺旋域附近更容易获得未经过修饰的氨基酸序列。

由于在驴、猪、牛的I型胶原蛋白α1序列相似位置都验证到具有物种专属性的特征肽，因此通过考察不同动物模拟酶切后的I型胶原蛋白α1序列，发现很多动物在此相似序列位置均可找到符合上述规律且适合三重四极杆串联质谱测定的差异肽段。这一发现得到相关文献印证，驴、马同属马科，亲缘性强，GEAGPAGPAGPIGPVGAR[28]为驴和马共有特征肽；GETGPAGPAGPIGPVGAR[28]为牛（哺乳纲，偶蹄目，牛科，牛属）的特征肽段，GETGPAGPAGPVGPVGAR[28]为猪（哺乳纲，偶蹄目，猪科，猪属）的特征肽段，GETGPAGPAGPPGPAGAR[29]为鸡（哺乳纲，鸡形目，雉科，原鸡属）特征肽段，GESGPAGPAGAMGPAGPR[30]为鱼（软骨鱼纲、硬骨鱼纲）特征肽段。因此初步推断，分属不同科或更高生物分类级别的动物在此序列位置容易找到差异肽段，这一点为今后探索胶原蛋白物种差异性及相关食品、药品真伪鉴别方法的建立提供了启发和思路。

模拟胰蛋白酶酶切3 条特征肽所在的非螺旋域序列，选取长度适合三重四级杆串联质谱分析的肽段，利用MRM方法对酶切肽段进行验证，结果表明有个别肽段在酶切后没有验证到（表3），因此推断此区域肽链很可能在加工过程中就已发生断裂。肽段①和肽段⑩在制胶后仍然能验证到（驴、猪、牛胶原蛋白的肽段⑩位置均为各自的特征肽），这说明非酶切断裂处虽然靠近螺旋域的两端，但并不是发生在三螺旋域和非三螺旋结构交界处，而是位于交界处向非三螺旋域延伸约10～25 个氨基酸残基处，非螺旋区域中段的肽段基本保持完整（图3）。大部分蛋白质中脯氨酸含量极低，而胶原蛋白中含有大量脯氨酸和羟脯氨酸，这两种氨基酸都是环状结构，因此胶原蛋白具有微弹性和很强的拉伸强度。以上研究表明，胶原蛋白肽链具有一定的拉伸强度，在高温加工过程中非螺旋域序列不会完全断裂，大部分肽段具有较好的热稳定性。

表3 制胶过程中非三螺旋域源肽段裂解情况Table 3 Cleavage of non-triple helix domain peptides during industrial processing of donkey-hide gelatin

图3 制胶过程中非三螺旋域裂解位点的比较分析Fig. 3 Comparison of non-triple helix domain cleavage sites during industrial processing of donkey-hide gelatin

2.4 马皮胶特征肽的检测结果

由于驴和马同为马科（Equidae）马属（Equidae），胶原蛋白亲缘性太强，因此马皮胶、生马皮的胶原蛋白的酶切溶液中可验证到驴的特征肽GEAGPAGPAGPIGPVGAR。利用Nano-UPLC-QTOFMS鉴定结果寻找马皮胶的特征肽，采用ProteinPilot软件搜索Uniprot数据库中物种蛋白序列信息，在置信度99%条件下，获得了2 条来自马源特征肽，其中一条LSVEADIN*GLR（*表示脱酰胺修饰）来源于马源角蛋白。角蛋白是构成表皮、毛皮及毛囊的主要蛋白质，由此可以分析得知这条肽段是由于皮类原料中残留的毛发或毛囊所带入的。但由于这条肽段丰度不高，在实际应用中需要对样品进行一定程度的浓缩处理。毛发和毛囊在生皮原料中很难完全去除，因此，从角蛋白角度寻找不同物种间的差异肽段实现溯源具备理论可行性。另一条马的专属特征肽ISGEWYSIFLASDVK，数据库信息尚不完全，目前肽段所属蛋白和源基因都未经命名，有待进一步研究。2 条肽段经过深加工过程仍能检测到，说明特征肽段稳定性良好，适合作为马皮特征肽。

表4 马皮胶特征肽段的MRM参数Table 4 MRM parameters for speci fi c peptides from horse-hide gelatin

利用Skyline软件构建马皮特征肽MRM方法离子对，通过高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，在生马皮酶解溶液、马皮胶酶解溶液中均检测到马皮特征肽离子，进一步证实了马皮特征肽的存在，且这2 条特征肽在阿胶、新阿胶、黄明胶样品中均未发现，即证明此2 条肽段为马皮胶的专属特征肽段。马皮胶特征肽二级质谱图见图4，驴、马、牛、猪皮源特征肽段XIC图见图5。

图4 Nano-HPLC-QTOF-MS对马皮胶特征肽的鉴定结果Fig. 4 Identification of specific peptides from horse-hide gelatin by Nano-HPLC-QTOF-MS

图5 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪对特征肽的鉴定结果Fig. 5 Identification of marker peptides by tandem mass spectrometry

3 结 论

针对阿胶中掺入新阿胶（猪皮胶）、黄明胶（牛皮胶）等低价胶类药材以及阿胶原料皮混杂马皮的现象，本研究从肽段层面解决阿胶中异源性物种的鉴别问题。首先利用鸟枪蛋白组学技术在I型胶原蛋白中分别检测到驴、牛和猪的特征肽段共4 条，可用于鉴别阿胶中掺入的新阿胶及黄明胶。其次在马源角蛋白和未命名蛋白中获得了2 条马皮特征肽段，可用于鉴别阿胶驴皮原料中混杂的马皮。同时，制胶过程中I型胶原蛋白的裂解规律以及胶原蛋白源物种特异肽段的序列特征的发现，不仅为从事阿胶异源性物种鉴别的科研人员提供了理论参考，还可以为其他动物源性食品或药材的物种鉴定提供理论指导和技术支持。