基于多重光谱技术的木糖醇与牛乳酪蛋白相互作用及对酪蛋白结构的影响

孔繁华，曹雪妍，康世墨，李玮轩，关博元，李墨翰，杨 梅，岳喜庆*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

牛乳酪蛋白（casein，Cs）具有丰富的营养价值，且由于其疏水性低、净电荷高，在天然条件下及加工过程中均呈现出独特的展开结构[1-2]，引起了人们研究它与花色苷、多酚、药物等物质相互作用的极大兴趣，并且有研究发现它们之间的相互作用会影响Cs的结构和功能性质。例如，He Zhiyong等[3]报道α-Cs和β-Cs分别通过亲水（范德华力或氢键）和疏水相互作用与麦芽糖-3-O-葡萄糖苷结合，并且对其热稳定性、氧化稳定性和光稳定性有积极作用；Bi Hongna等[4]研究发现盐酸四环素对牛乳β-Cs、α-乳白蛋白的猝灭机制是静态猝灭，分别通过静电引力和氢键而发生结合相互作用，使两种蛋白质的二级结构发生了显著变化，且表面疏水性也有所降低。Haratifar等[5]发现茶多酚与Cs相互作用形成的复合物能够影响凝乳酶诱导的牛奶凝胶化，且影响是有浓度依赖性的。

木糖醇（xylitol，XY）是一种天然的多元醇，是良好的助溶剂，具有类似蔗糖的甜味能力，常见于水果和蔬菜中，在体内消化时，能做到不引起胰岛素含量上升，不给糖尿病患者的代谢增加负担，还常被用作为营养补充剂，在医药工业和食品工业中都起着至关重要的作用[6-7]。目前已经有大量研究表明XY等糖醇化合物能够改善球状蛋白质的功能特性，例如热稳定性、胶凝性、起泡特性以及乳化稳定性等，并且对它们起到稳定和保护的作用。Pan Mingzhe等[8]研究发现XY等助溶剂能使大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）的二级结构变得更加有序，而结构的变化导致SPI的发泡性和表面疏水性降低，溶解性增加；Kommineni等[9]研究了XY对低脂工艺奶酪功能特性的影响，发现加入XY后，低脂工艺奶酪的硬度显著降低，流变性能等功能性质有所提高。但相关研究尚未涉及XY与Cs的相互作用以及对蛋白质结构和功能特性的影响，因此明确XY与Cs的相互作用不仅可以显著提高XY的生物利用率，还有可能改善Cs的功能性质。

本研究旨在利用多重光谱相结合的技术研究XY与Cs的相互作用机制以及对Cs结构和功能特性的影响。拟采用荧光猝灭法研究XY对Cs的猝灭机制，判断二者之间是否存在相互作用，并计算二者的结合常数、结合位点、结合距离以及相关的热力学参数，探讨二者的相互作用机制；利用同步荧光光谱法研究XY主要结合的氨基酸残基；利用三维荧光光谱法研究XY对Cs中氨基酸残基微环境极性的影响，进而推测对Cs构象的影响；采用傅里叶变换红外光谱和圆二色谱法分析评价Cs二级结构及相对含量的变化，进一步验证XY与Cs相互作用的存在，此外还对复合物的乳化性和表面疏水性进行测定，从而为XY在乳制品中的添加及功能性乳基料的开发提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆色拉油 益海嘉里食品营销有限公司。C s（蛋白质含量≥9 5.0%，相对分子质量为50 000～37 5000）、XY（纯度＞99%，相对分子质量为152.1） 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4），NaOH、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 国药集团化学试剂有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）美国Sigma公司；实验所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

F-4600荧光光谱仪 日本日立公司；FT-IR200傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo公司；RH basic2磁力搅拌器 广州科仪实验室技术有限公司；Cary 50紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；J-810圆二色谱仪日本Jasco公司；MP2002电子天平 上海舜宇科学仪器有限公司；冷冻真空干燥机 抚顺康源保鲜技术发展公司；DK-S26数显电子恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；PHS-25型数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；T18 basic高速分散器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

参考赵焕焦等[10]的方法配制1 mg/mL的Cs储备液；参考Chen Haiying等的方法[11]，略有改动，配制XY溶液：称取适量XY固体，溶于0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌30 min（确保充分溶解），定容，配制成0.1 mol/L的XY原溶液，再用Tris-HCl溶液将其稀释到1×10－5mol/L，备用。Cs溶液和XY溶液均现配现用。

1.3.2 内源荧光光谱测定

取1 mL 1 mg/mL的Cs溶液和适量1×10－5mol/L的XY溶液于试管中，使最终Cs与XY浓度比为1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，每次加入25 μL XY溶液，充分振荡混合均匀，分别置于300、310 K和320 K的水浴锅中加热恒温30 min，激发波长选择280 nm，狭缝均为5 nm，扫描300～450 nm的发射光谱。分别在波长差Δλ为15 nm和60 nm条件下，扫描样品在220～350 nm范围内的同步荧光光谱。

三维荧光光谱在以下条件下进行：初始激发波长为200 nm，增量为5 nm，发射波长在200～450 nm之间，激发和发射狭缝宽度分别为5 nm。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

将Cs和Cs与XY浓度比为1∶4的样品溶液置于超低温冰箱中预冷冻3～4 h，再置于冷冻真空干燥机中干燥24 h，获得样品粉末，将冻干样品与KBr按照质量比为1∶100混合，研磨均匀，置于模具中压片，以KBr作为背景，对样品的全波段（4 000～400 cm－1）进行扫描，分辨率为4 cm－1，扫描次数为32 次。使用Omnic软件进行数据分析，然后用Origin作图。

1.3.4 圆二色谱分析

用Jasco-815圆二色谱仪在25 ℃条件下测定样品在远紫外区域（190～250 nm）的圆二色谱，以0.1 mol/L NaOH和0.05 mol/L Tris-HCl混合液为空白缓冲液，将缓冲溶液加入比色皿中，比色皿光径为0.1 cm，测定远紫外区的圆二色谱。扫描速率100 nm/min，数据间隔1.0 nm，带宽2.0 nm，扫描3 次，取平均值得到最终的圆二色谱。

1.3.5 乳化性测定

取9 mL蛋白质质量浓度为1 mg/mL的复合物溶液与3 mL大豆油混合，10 000 r/min高速分散处理1 min形成均一的乳状液，分别在0 min和10 min，用微量注射器从底部取50 μL液体，用0.1% SDS溶液（pH 7）稀释100 倍，将上述的溶液充分混合均匀，均匀后测定样品在500 nm波长处的吸光度，以SDS溶液为空白。乳化活力指数和乳化稳定指数计算公式如下：

式中：EAI为乳化活力指数/（m2/g）；ESI为乳化稳定指数/min；DF为稀释因子，100；C为蛋白质质量浓度/（g/mL）；φ为比色皿光径（1 cm）；θ为油相体积分数（0.25）；A0、A10分别为0 min和10 min时的吸光度。

1.3.6 表面疏水性测定

采用荧光探针法，用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液将样品稀释成不同浓度的溶液，使溶液中蛋白质质量浓度在0.01～0.1 mg/mL之间。取不同质量浓度的稀释样品5 mL，加入25 μL的ANS溶液（用pH 7.4、0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液配制成8 mmol/L的溶液），振荡混合均匀，并于室温下暗反应处理5 min。在激发波长390 nm、发射波长470 nm、激发和发射狭缝宽均为5 nm条件下，测定样品的荧光强度。以荧光强度对蛋白质质量浓度作图，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。

1.4 数据统计与分析

每组数据均重复做3 次，采用Origin 9.0软件和Excel作图，用SPASS 7.8软件进行误差分析。

2 结果与分析

2.1 内源性荧光光谱分析

图1 XY的荧光光谱图Fig. 1 fl uorescence spectrum of XY

图2 Cs与XY相互作用的荧光猝灭图（T=300 K）Fig. 2 Fluorescence quenching of the interaction between XY andCs(T = 300 K)

图1 为同一条件下获得的XY的发射光谱，图中有两个吸收峰，一个位于311 nm附近，一个位于362 nm附近，荧光强度都较弱，可以忽略不计，故不会对Cs的荧光发射光谱产生影响。

Cs自身含有3 种生色基团——色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。当在280 nm波长激发时，普通具有荧光的蛋白质分别在348、303、282 nm波长处出现吸收峰，强度比约为Trp∶Tyr∶Phe＝100∶9∶0.5[12-13]。如图2所示，纯Cs溶液（曲线1）的最大发射波长（λmax）约在350 nm处，可以判断促使Cs发荧光的主要是Trp残基。

由图2还可以看出，随着XY浓度的不断增加，Cs的荧光强度（F）不断降低，当Cs与XY的浓度比从1∶0达到1∶10时，F从1 974减少至382，XY对Cs的内源荧光产生了荧光猝灭作用，表明XY可能与Cs发生了相互作用。此外还发现，Cs的λmax从350 nm蓝移到340 nm，可能是由于Cs中的Trp和Tyr是具有相对较强疏水性的氨基酸残基，其荧光光谱对于周围微环境的变化比较敏感，有研究表明，荧光物质的发射光谱蓝移表明Trp残基附近的微环境发生改变，红移则对应Tyr残基附近微环境的改变[14]。因此可以说明Cs与XY发生了相互作用，使Cs中Trp残基附近的极性降低，使其处于更疏水的环境中[15]。类似研究结果如杨国平等[16]经过研究表明XY能通过与人血清白蛋白的相互作用而对其产生荧光猝灭效应。

2.2 XY与Cs的猝灭效应

蛋白质发生荧光猝灭的机理有两种，动态猝灭和静态猝灭。为区分猝灭机理，进行了温度实验。通常用Stern-Volmer曲线方程描述[17]：

式中：F0为Cs的荧光强度；F为加入XY后Cs的荧光强度；Ksv为Stern-Volmer动态猝灭常数/（L/mol）；Kq为双分子猝灭过程的速率常数/（L/（mol·s））；CQ为XY浓度/（mol/L）；τ0为XY不存在时Cs的平均荧光寿命/（10－8s）。

图3 300、310 K和320 K时XY对Cs荧光猝灭的Stern-Volmer方程Fig. 3 Stern-Volmer curves of fl uorescence quenching of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

表1 不同温度下XY与Cs的Stern-Volmer猝灭常数Ksv和双分子猝灭过程的速率常数KqTable 1 Stern-Volmer quenching constants and bimolecular quenching constants of XY with Cs at three temperatures

根据式（3）用F0/F对CQ作图，可以得到Cs与XY相互作用的Stern-Volmer曲线，如图3所示，根据图中的直线斜率可以计算出公式中的Ksv和Kq，结果见表1。F0/F与CQ呈现出良好的线性关系，说明在反应过程中只存在一种猝灭机制。根据动态猝灭和静态猝灭对于温度偏好的不同[18]以及结合表1结果发现，3 个温度下的Ksv值随着温度的升高而变小，符合静态猝灭的规律。而且XY对Cs猝灭的速率常数Kq大于生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0×1010L/（mol·s），因此，可以判断XY对Cs内在荧光猝灭效应的机制主要是通过与Cs形成新的复合物的静态猝灭[3]。表1中的相关系数均在0.99以上，说明XY与Cs相互作用的Stern-Volmer曲线方程给出的结合模式是可靠的。张青等[19]研究左氟沙星与Cs的相互作用时也得出了相同的结论。

2.3 结合常数（KA）及结合位点数（n）的计算

对于静态猝灭过程，遵循下列公式[20]：

式中：F0、F、CQ同式（3），KA为结合常数；n为结合位点数。以lg[（F0－F）/F]对lgCQ作图（根据式（4）），可以得到XY与Cs相互作用的双对数回归曲线（图4）。

图4 不同温度下XY与Cs相互作用的双对数回归曲线Fig. 4 Linear plot of lg [(F0−F)/F] versus lgCQ of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

表2 不同温度下XY与Cs的结合常数KA、结合位点数n及热力学参数Table 2 Binding constants and thermodynamic parameters of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

根据图4中直线的斜率和截距可以计算出XY与Cs相互作用的结合位点数n和结合常数KA，结果见表2。可以看出，XY与Cs之间至少存在一个结合位点。结合常数KA较大，数量级在106左右，随着温度的升高，KA逐渐降低，表明在结合过程中生成的复合物Cs-XY不稳定，当温度升高时，复合物可能部分分解。KA和n的值都随着温度的升高而下降，与2.2节中Ksv的趋势一致，再次证明该过程的猝灭机制属于静态猝灭。Zhang Yezhong等[21]利用荧光光谱研究牛血清白蛋白与对氨基偶氮苯的相互作用时也发现二者的结合常数KA随着温度的升高而逐渐变小，猝灭机制属于生成了不稳定复合物的静态猝灭。

2.4 热力学参数与作用力

小分子和蛋白质等大分子之间的相互作用主要涉及4种结合力：疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等。如果温度变化范围不太宽，可以将相互作用中的ΔH视为常数。根据Van’t Hoff方程（式（5））和热力学关系（式（6））[22]计算∆G、∆H和∆S：

式中：KA为温度T条件下的结合常数，R为气体常数（8.314 J/（mol·K））。

根据公式（5）以lnKA对1/T作图，由直线的斜率和截距能分别求出热力学参数焓变（∆H）和熵变（∆S），代入式（6）可以求得∆G，结果见表2。从表2可以看出，XY与Cs相互作用的过程中∆G＜0，表明该结合过程是自发进行的；∆H＜0，∆S＞0，说明Cs与XY之间的相互作用属于放热反应，反应中的主要作用力为静电引力[23]，但是考虑∆S＞0，所以也不排除疏水性相互作用在其中起作用[13]。An Xin等[17]对硫鸟嘌呤与人血清白蛋白相互作用进行了研究，发现二者之间的结合类型也属于自发的放热反应。

2.5 结合距离

根据福斯特能量转移理论[24]，能量转移效率E由式（7）给出：

式中：r为供体-受体间的距离/nm；R0为转移效率为50%时的临界距离/nm。

式中：K2为与偶极子给体-受体的几何形状相关的取向因子，液体溶液中通常取2/3；n为介质的折射率（1.336）；Φ为供体的荧光量子产额，取值为0.4；J为供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分。这里的供体和受体分别为Cs和XY。J由式（9）给出：

式中：F（λ）为Cs在λ波长处的荧光强度；ε（λ）为XY在λ波长处的摩尔吸光系数。从这些关系中，可以计算出J、R0和E，因此也可以计算出r的值。

图5 Cs的荧光发射光谱（a）和XY的紫外吸收光谱（b）的重叠光谱图Fig. 5 Overlapped fl uorescence spectra of Cs (a) and UV absorption spectra of XY (b)

Cs荧光光谱与XY吸收光谱的重叠图见图5。根据式（7）～（9）计算出J值为6.170×10－15cm3·L/mol。所以，R0=2.783 nm，r=3.564 nm，E=0.2。r值均小于7 nm，0.5R0＜r＜1.5R0，表明XY与Cs的结合反应是通过能量转移的可能性很大[25]，且能猝灭Cs中发色团（主要是色氨酸残基）的荧光。此外，供体与受体之间的距离在2～8 nm范围内，这再次说明了该结合作用属于静态猝灭[26]。

2.6 同步荧光光谱分析

根据Miller提出的理论，当∆λ为15 nm和60 nm时分别仅反映Tyr和Trp的特征荧光光谱[27]。Tyr和Trp的最大发射波长容易受其周围环境极性的影响，因此常被用来表征蛋白质构象的变化。

图6 ∆λ为15 nm（a）和60 nm（b）时XY与Cs相互作用的同步荧光光谱图Fig. 6 Synchronous fl uorescence spectra of Cs in the presence of XY at∆λ = 15 nm (a) and ∆λ = 60 nm (b)

从图6可以看出，随着XY用量的增加，Cs两个不同波长差的同步荧光光谱均明显降低，这与He Zhiyong等[3]研究锦葵-3-O-葡萄苷对牛乳α-Cs和β-Cs同步荧光光谱影响的结果相似，表明Cs分子中的Tyr和Trp均由于XY的加入而被不同程度的猝灭，但相比之下，Trp的被猝灭程度要大于Tyr，由此可以判断XY主要结合在Cs的Trp残基上；此外，∆λ为60 nm的谱图表现出明显的蓝移现象，而∆λ为15 nm谱图的出峰位置几乎没有变化。因此，当XY与Cs结合后，主要作用于Cs分子中的Trp附近，使Trp周围微环境的疏水性增强，极性减弱，进而使Cs分子的结构变得更加紧密[28-29]，与2.1节得出的结果相对应。

2.7 三维荧光光谱分析

为进一步了解XY对Cs构象的影响，对蛋白质和蛋白质-XY复合物的三维荧光光谱进行测定。图7为加入XY前后Cs的三维荧光光谱等高线图，相应的参数如表3所示。左上角类似“铅笔型”的峰是瑞利散射峰（λex=λem），右下角的“指纹型”线符合λex小于λem的规律，是典型的色氨酸和酪氨酸残基荧光峰的特征[30]。从峰的位置来看，加入XY后，Cs中瑞利散射峰的起始位置和荧光峰位置均无明显变化。从峰的强度来看，随着XY浓度的增加，两种峰都变的稀疏，说明加入XY后瑞利散射峰和荧光峰的强度均有不同程度的降低，说明色氨酸和酪氨酸残基附近的微环境发生了变化，进而可以推测XY与Cs间存在相互作用，且二者能够形成复合物，并改变Cs的微环境和构象[31]，这与同步荧光的结果一致。

图7 Cs和Cs-XY体系的三维荧光等高线图Fig. 7 Three-dimensional fl uorescence contour map of Cs and Cs-XY systems

表3 Cs与XY相互作用的荧光激发-发射矩阵光谱Table 3 Fluorescent EEM spectral characteristics of Cs-XY systems

2.8 傅里叶变换红外光谱分析

红外光谱法是研究小分子与生物大分子之间相互作用时二级结构的变化的有效方法之一[32]，它具有比紫外吸收光谱和荧光光谱更精细的信息，能准确反映出酰胺I带和酰胺II带的强度变化和光谱移位，且已经成功运用于蛋白与多酚的相互作用中[33]。

图8 Cs和Cs-XY的红外光谱图Fig. 8 FTIR spectra of Cs and Cs-XY complex

如图8所示，Cs和Cs-XY复合物的出峰位置基本一致，略有移动，纯Cs的酰胺I带主要出现在1 635 cm－1处，加入XY之后，Cs的酰胺I带移动到1 632 cm－1处；酰胺II带从1 538 cm－1移动到1 554 cm－1处，说明Cs与XY发生了结合作用，且这种结合作用引起了Cs二级结构的改变，推测其变化原因可能是XY与Cs肽链上的—C＝O—和—C—N—基团发生了结合作用[34]；此外，Cs的酰胺I带和酰胺II带的强度有所降低，说明α-螺旋相对含量在加入XY后明显减少。这与Kanakis等[35]研究白藜芦醇、染料木黄酮和姜黄素对牛乳α-Cs和β-Cs二级结构影响的结果一致。

2.9 圆二色谱分析

图9 Cs和Cs-XY的远紫外圆二色谱图Fig. 9 Circular dichroism spectra in the far-UV region of Cs and Cs-XY systems

圆二色谱法常被用来定量测定蛋白质二级结构的相对含量。它的测定范围分为远紫外区（170～250 nm）和近紫外区（250～300 nm），远紫外区能够显示主链的构象变化[36]。Cs与XY体系的圆二色谱图见图9，利用SELCON3程序对Cs和Cs-XY中二级结构相对含量变化的计算结果见表4。

表4 Cs和Cs-XY二级结构的相对含量Table 4 Secondary structure composition of Cs and Cs-XY systems%

从图9可以看出，纯Cs在220～230 nm间有两个明显的负峰，这是蛋白质中α-螺旋结构的典型特征；在加入XY之后，随着XY浓度的增加，Cs的两个负峰呈现上升的趋势，表明Cs的结构从无序转变为有序。这与毕红娜[37]用圆二色谱的方法研究盐酸四环素与3 种牛乳蛋白相互作用时结构变化的结果相同。如表4所示，游离Cs的α-螺旋相对含量为54.91%，当加入XY后，α-螺旋相对含量在不断减少，其可能部分转变成了β-折叠、β-转角和无规卷曲结构。这些圆二色谱结果证明了Cs与XY的相互作用导致Cs二级结构的变化，与傅里叶变换红外光谱得出的结果相一致。

2.10 乳化活性和乳化稳定性分析

图10 不同浓度XY对Cs乳化活性（a）和乳化稳定性（b）的影响Fig. 10 Effect of XY concentration on emulsification activity (a) and emulsion stability (b) of Cs

从图10a可以看出，随着所加入XY浓度的增加，Cs的乳化活力指数逐渐降低，乳化稳定性逐渐升高。结构决定功能，由2.9节结果可知，在XY的作用下，Cs的α-螺旋相对含量减少，使其二级结构变得更加致密、有序，分子的柔顺性降低，进而导致Cs的乳化活力指数降低[38]。乳化稳定性逐渐升高，表明XY使Cs乳化液的稳定性增加。这可能是由于XY的添加，增加了Cs乳化液的表观黏度，使乳化液微粒间的碰撞频率减少，从而提高了蛋白质乳化液的稳定性。这与Pan Mingzhe等[8]的研究结果一致。

2.11 表面疏水性分析

图11 不同浓度XY对Cs表面疏水性的影响Fig. 11 Effect of XY concentration on surface hydrophobicity of Cs

如图11所示，随着XY浓度的增加，Cs表面疏水性整体呈现下降的趋势，当Cs与XY浓度比为1∶10时，Cs的表面疏水性从252降低到127，可能是由于XY与Cs在水溶液中能直接形成氢键，使Cs分子周围形成亲水层，增强了蛋白质的水化作用，从而降低蛋白质的表面疏水性[39]。还有可能是因为多元醇可以进入蛋白质内部诱导疏水表面区域的重新排列，从而抑制疏水探针与蛋白的结合。这也为Cs的二级结构变得致密，有序提供了有利的证据。同时也表明Cs的三级结构可能也发生了变化。

3 结 论

通过利用荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、傅里叶红外光谱和圆二色谱的多光谱组合法探究XY对Cs光谱性质以及结构的影响，并测定了其乳化性和表面疏水性的变化，有助于更好地理解牛乳蛋白质和XY之间的结合过程中涉及的化学机理，为功能性乳基料的生产提供理论依据。具体得出以下结论：1）XY对Cs的荧光猝灭机制是静态猝灭，生成了Cs-XY复合物，结合常数较大，且随着温度的升高而降低，说明生成的复合物不稳定。二者至少存在一个结合位点，结合距离为3.56 nm，结合过程是一个自发的放热反应，主要作用力是静电引力和疏水作用力。2）XY的结合位点更接近于色氨酸，使色氨酸周围的微环境变得更加疏水，从而引起Cs的结构发生部分变化，进一步说明Cs与XY发生了相互作用。3）傅里叶变换红外光谱和圆二色谱的结果表明，与XY相互作用后，Cs的α-螺旋结构相对含量从54.91%降至44.97%，其他组分的相对含量略有增加，结构更趋向于紧密状态，证明XY的存在确实会影响Cs的二级结构。4）在XY的作用下，随着XY浓度的增加，Cs的乳化活性降低，乳化稳定性增加，表面疏水性降低，证实了Cs的结构发生了变化。