miR-222 靶向BBC-3基因对肝癌细胞增殖凋亡的调控研究

孙景武 刘志春 党存曙 刘 彬 邢恩涛

微小RNA是1类长度为22nt大小的小分子非编码RNA，其主要是通过与靶基因的mRNA 3'端完全或不完全互补结合而调控基因的表达，进而对细胞的增殖、分化以及凋亡产生影响[1-2]。miR-22是1种较常见的致癌miRNA，其在细胞内的表达会影响多种肿瘤细胞的增殖、凋亡以及侵袭能力[3-4]。

BBC-3基因即p53上调凋亡调控因子(p53 up-regulated mod-ulator of apoptosis，PUMA)，是1种促凋亡基因[5]，因p53因子可以迅速诱导其产生强大的促凋亡作用而得名。BBC-3作为p53的下游靶基因，在p53依赖和非依赖途径凋亡过程中均发挥重要的作用。有研究表明，BBC-3与肝癌、直肠癌、口腔癌以及乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展有密切关系[6-9]。

前期利用生物信息学和荧光素酶报告研究表明，miR-222可以与3'UTR基因位点直接结合而共同调节BBC-3基因的表达，而促进细胞发生凋亡[10]。Zhang等[11]的研究报告表明，miR-222联合基因转染乳腺癌、胶质母细胞瘤以及肺癌后BBC-3基因的表达升高，促进肿瘤细胞凋亡。本研究通过miR-222转染进入HepG细胞后，BBC-3基因表达水平的变化，并检测HepG细胞的增殖及凋亡能力，从而为肝癌基因新的治疗方式提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

miR-222与miR-222 inhibitor均由上海生物工程技术有限公司合成；HepG2肝癌细胞系购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI 1640培养基、胰酶均购自Sigma公司：LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂与Trizol均购自美国Invitrogen公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Western-blot电泳液和转膜液、MTT均购自宝生物工程(大连)有限公司；BBC-3抗体、抗兔IgG二抗均购自艾美捷科技有限公司；FITC和PI的细胞凋亡试剂盒购自Thermo Fisher公司。

1.2 合成的引物序列

miR-222引物序列：F：5'-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACTG-3'，R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；内参U6引物序列：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；BBC-3引物序列：F： 5'-CAGGAAAGGCTGTTGTGCTG-3'，R：5-AGTGGTCACGTTTGGCTCAT-3'；内参片段18S引物序列为：F：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，R：5 '-GCGGCAATACGAATGCCCC-3'。

1.3 细胞培养与转染

HepG2细胞培养于RPMI 1640培养基(含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每24 h换液1次。细胞生长铺满瓶底约80%时，加入0.25%胰蛋白酶和0.05%EDTA进行消化。取对数生长期的细胞，以每孔1×105个的密度接种于6孔板上，在CO2培养箱中培养过夜。待细胞生长至60%～80%时，吸去完全培养基，用PBS重新2遍，在每孔加入1 ml无抗生素和血清的opti-MEM培养基。吸取10 μl 20 μmol/l的miR-222和miR-222 inhibitor溶解于opti-MEM培养基中，混匀静置；将5 μl LipfectamineTM RNAiMAX加入500 μl opti-MEM培养基中，混匀静置。5 min后将上述两种溶液混合，静置20 min，分别加入各孔中，放入CO2培养箱中，4～6 h后，加入转染培养基，每孔加入2 ml含血清的完全培养基。

1.4 RT-PCR检测细胞中基因表达

转染24 h后收集培养的细胞，加入Trizol试剂并提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书合成cDNA。miR-222反应体系为：cDNA 5.0 μl；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl；加超纯水Total 20 μl。

反应条件：95 ℃变性5 min，95 ℃ 45 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸32 s，40个循环，72 ℃ 10 min。BBC-3反应体系及反应条件同miR-222。

1.5 Western blot检测细胞BBC-3蛋白的表达

转染48 h后，分别提取三组细胞的总蛋白，测定蛋白浓度，经SDS-PAGE后转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入稀释好的BBC-3待检蛋白和内参GAPDH一抗，4 ℃过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，加入二抗在室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次5 min，ECL试剂盒显影，凝胶成像系统拍照，表达强度以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比表示。

1.6 MTT法检测细胞增殖

取处于对数生长期的细胞，以5×103个/孔接种在96孔板上，三组均设置3个复孔。空载体对照组用含10%FBS的RPMI 1640溶液进行培养，转染组分别把miR-222与miR-222 inhibitor转入细胞内，操作同1.3，在转染后的24、48、72 h三组细胞均加入5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃ CO2放置4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl DMSO溶液，震荡溶解紫色晶体，在490 nm波长的酶标仪测定吸光度值，检测三组细胞的生殖情况。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率

转染48h后，每组收集1～5×105个细胞，PBS清洗并用70%乙醇固定，过夜，离心收集细胞，PBS洗涤1次，加入500 μl的50 μg/ml的PI、0.2%Triton X-100的PBS以及100 μg/ml 的RNase A，4 ℃避光孵育30 min，利用流式细胞仪检测各组细胞周期；按上述同样方法收集洗涤的细胞，无需乙醇进行固定，加入AnnexinV-FITC，室温避光孵育15 min，以1 500 r/min离心5 min，去除上清，用预冷的缓冲液将细胞重悬，加入PI，利用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。

1.8 统计学处理

应用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，两组间均数比较采用t检验，两组间率的比较采用四格表资料的χ2检验结果，P<0.05认为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 荧光倒置显微镜下观察转染效率

空载体转染组、miR-222转染组和miR-222 inhibitor转染组转染24 h后，荧光倒置显微镜下观察各组细胞中红色荧光，miR-222转染组和miR-222 inhibitor转染组的均成功进行转染，而空白对照组荧光较少。

2.2 转染后miR-222的表达

转染48 h后，RT-PCR检测空载体、miR-222 inhibitor和miR-222转染组中miR-222 RNA相对样品初始模板量的表达水平分别为(460.09±45.77)、(429.34±36.78)和(1.00±0.08)，miR-222转染组细胞miR-222表达明显下调，与空载体和miR-222 inhibitor转染组相比具有差异统计学意义(P<0.01)：而miR-222 inhibitor转染组与空白对照组相比，miR-222表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 RT-PCR检测转染后miR-222的表达情况

2.3 转染后BBC-3蛋白的表达水平

Western blot检测结果表明，miR-222转染组细胞BBC-3蛋白的表达水平与空载体转染组和miR-222 inhibitor转染组相比表达显著增加。利用软件AlphaView计算空载体转染组、miR-222 inhibitor转染组、miR-222转染组的BBC-3蛋白与内参GAPDH蛋白的灰度值之比，分别为(1.29±0.13)、(1.32±0.09)和(1.85±0.15)，miR-222转染组与空载体和miR-222 inhibitor转染组转染相比BBC-3基因表达明显增加，具有差异统计学意义(P<0.01)，表明miR-222基因转染上调BBC-3基因表达，见图2和图3。

图2 转染后BBC-3蛋白的表达情况

图3 不同转染组BBC-3蛋白与内参灰度值之比

2.4 转染对肝癌HepG2细胞增殖的影响

MTT法检测细胞增殖结果表明，24 h、48 h、72 h时miR-222转染组吸光度值均小于空载体转染组和miR-222 inhibitor转染组，miR-222转染组细胞增殖能力明显低于空载体转染组和miR-222 inhibitor转染组(P<0.05)，表明下调miRNA-222水平可抑制肝癌HepG2细胞增殖，见表1。

2.5 转染后细胞凋亡率的变化

三组细胞的凋亡率分别为2.65%、2.72%和13.58%，miR-222转染组与空载体转染组和miR-222 inhibitor转染组相比较细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

BBC-3是新发现的具有强大促凋亡作用的Bcl-2蛋白家族中的一员，作为p53的靶基因，是p53诱导凋亡途径中的关键介导者。研究结果表明，无论是由射线、缺氧、药物、DNA损伤等引起的内源性p53表达上调还是p53外源性转染，其引发的促细胞凋亡作用均是通过上调BBC-3基因表达介导的，BBC-3突变或缺失可导致细胞凋亡率降低[12-13]，说明BBC-3是凋亡通路的关键基因。近年来相继有学者研究发现，BBC-3在许多恶性肿瘤的发生、发展及治疗过程中均有强大的促凋亡作用。肿瘤是异常基因表达的结果，miRNA表型实验表明许多miRNAs在多种肿瘤中异常表达，主要通过靶分子识别、癌基因或抑癌基因、突变或含有miRNAs染色体片段缺失3种机制参与癌症发生。特定的miRNAs表达改变可启动和促进肿瘤发生，部分组织中miRNAs可能扮演着癌基因或者抑癌基因的角色[14-16]。MiR-222是常见的致癌miRNA之一，其表达上调与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡能力有关。有学者研究发现，肝细胞生长因子受体可转录活化c-Jun，从而上调miR-221/222表达，上调的miR-221/222作用于PTEN和TIMP3，拮抗TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)引起的凋亡.增强肝癌细胞的恶性生物学特性[17]。Pineau等[18]在对人体肝癌组织及肝癌细胞的研究中进一步证实了上述观点，此外还发现miR-221/222可以通过下调p27Kipl表达增强肝癌细胞的增殖能力。

表1 MTT检测不同转染时间细胞增殖情况

注：miR-222转染组与空载体转染组比较：*为P<0.05；miR-222转染组与miR-222 inhibitor转染组比较：△为P<0.05。

利用生物信息学软件分析肝癌组织中与BBC-3基因密切相关的miRNAs时发现，sIANAmT、miRanda、miRwalk、RNAhybrid、PITA、Targetscan等八大靶基因预测数据库均显示miR-222与BBC-3基因高度相关。肝癌中有关miR-222与BBC-3的关系尚无明确报道.但其在某些肿瘤中已有相关研究。Zhang等研究发现，神经胶质瘤组织中miR-221/222含量降低可诱导BBC-3基因表达，促进细胞凋亡，显著抑制异种移植瘤的生长，表明miR-221/222与BBC-3间存在相反关系，miR-221/222通过靶向调节BBC-3表达直接促进神经胶质瘤细胞凋亡，可作为潜在的治疗神经胶质瘤的靶点。在对人类上皮癌细胞的研究中进一步发现，miR-221/222含量降低可抑制乳腺癌、肺癌等上皮癌细胞增殖.诱导线粒体介导的凋亡。

近年来，效果还有一定差距，可能与miR-222对肝癌细胞抑制作用的具体机制及其有其他作用靶点等有关，有待进一步研究。随着研究的不断深入。miR-222基因转染靶向调控BBC-3基因表达促进细胞凋亡有望为临床治疗肝癌提供实验依据。在恶性肿瘤发生、发展中的作用受到越来越多的关注，但其在口腔癌中的研究却明显滞后，miR-222靶向调节BBC-3基因表达促进细胞凋亡的具体机制还有待证实。本研究通过miR-222基因转染抑制细胞内miR-222表达，敲低内源性miR-222表达量。RT-PCR结果表明，下调miR-222可诱导促凋亡基因BBC-3表达增加，两者间存在反向关系，Western blot在蛋白水平上进一步证实了该观点。MTT细胞增殖实验结果显示，miR-222表达量降低，HepG2细胞增殖速度明显下降，在肝癌中miR-222发挥着促癌作用。通过流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率得知，miR-222转染组较其他两组而言G1期细胞数明显增多，细胞凋亡率显著增高，证明miR-222表达降低可影响HepG2细胞周期，促进细胞凋亡，进而发挥抗癌作用。结果与Zhang等在人类上皮细胞癌中的研究结果相吻合。但该实验中，实验组细胞凋亡率为13.58%，虽然较对照组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义，但是距离肿瘤的理想治疗效果还有一定差距，可能与miR-222对肝癌细胞抑制作用的具体机制及其有其他作用靶点等有关，有待进一步研究。随着研究的不断深入。miR-222基因转染靶向调控BBC-3基因表达促进细胞凋亡有望为临床治疗肝癌提供实验依据。